巨细胞-IgM抗体酶免测定标准操作程序.docVIP

人类巨细胞-IgM抗体酶免测定标准操作程序 编写者：宿金涛 日期：2012年3月1日 预期用途：利用酶联免疫吸附法（ELISA）定性人血清或血浆中的人类巨细胞病毒（HCMV）IgM抗体，用于人类巨细胞病毒感染的辅助诊断及流行病学调查。HCMV是引起人类先天性畸形的重要原因之一，孕妇的原发或新的复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染，砂性孕期感染HCMV的胎儿80%可出现智力低下、视力受损、听力丧失等症状。原发性HCMV感染给免疫抑制患者带来严重后果甚至危及生命，骨髓移植中因HCMV感染导致的间质性肺炎死亡率达75%。近来发现HCMV是艾滋病患者机会感染病原之一。巨细胞病毒属疱疹病毒β亚科，其主要感染途径是直接或间接接触，包括接触被感染病人的唾液、生殖器分泌物、尿液和乳汁，同时也可以通过胎盘传播或发生医源性传染。病毒感染后，血清中CMV-IGM抗体持续4-6个月均可测出，个别情况可持续数年，血清中CMV-IGM抗体相对恒定地终身存在。CMV-IGM抗体检出可用于急性CMV感染的诊断，但不能区分原发性感染和复发感染。CMV-IGG抗体检出可用于诊断有无CMV感染，并对易感人群采取适当措施。因此HCMV抗体的检测对免疫受损患者、孕妇、器官移植的供受双方及献血者有重要意义。 二、检验原理：本试剂盒采用捕获原理检测人血清或血浆样品中人类巨细胞病毒IGM抗体（HCMV-IGM），微孔中预包被鼠抗人-IGM(μ链），首先加入待检标本的血清或血浆样品后，样品中的IGM抗体都可被捕获，未结合的其他成分（包括特异的IGG抗体）将被洗涤除去；第二步，加入酶标记物，酶标记物是辣根过氧化物酶（HRP）标记的基因重组抗原HCMVrp52-65.被捕获的IGM中的HCMV-IGM会与辣根过氧化物酶标记的HCMV重组抗原特异性的结合，洗去其它未结合物，最后用TMB底物显色。通过酶标仪检测吸光度（A值）从而判定样品中HCMV-IGM抗体的存在与否。 二、试剂：贝尔生物。规格为1*48人份/盒。1*96人份/盒。 试剂文号：国食药监械（准）字2011第3400637号 三. 仪器：ST-36W洗板机;reader HT2 酶标仪。 四.操作步骤： 1、取出试剂盒置室温平衡30分钟。将20*洗涤液用蒸馏水做20倍稀释（600ml/48T,1000ml/96T). 2、加样品：取50ul待检血清加入反应板孔内，同时预留阴、阳性及空白对照共5孔。 3、加入阴生对照3孔，阳性对照1孔各50ul对照血清。空白对照1孔空置。将反应板轻轻震汤使样品混匀。 4、温育：用封板膜封板板后，置37℃温箱中反应30分钟。 5、洗板：温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30~60秒种。 6、加酶标工作液：每孔加入50ul酶标工作液，空白孔除外。 7、温育：用封板膜封板板后，置37℃温箱中反应30分钟。 8、洗板：温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30~60秒种。 9、显色：每孔加入底物A、B液各50ul，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置37℃温箱中反应15分钟。 10、终止：每孔加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。 11、测定：设定酶标议波长于450nm(建议双波长450/630nm检测），测定各孔A值。注意：终止反应10分钟内读数。 12、当使用单波长时，校准空白孔，设定酶标仪波开于450nm，测定各孔A值，当使用双波长450/630检测时，可以不设空白孔，直接测定各孔A值。 结果判断 目测结果：标本孔无色或浅于阳性对照孔的颜色为阴性；标本孔深于或等于阳性对照孔的颜色为阳性。 机测结果：每个试验结果独立使用，通过（cut off)值判定结果。 计算临界值：Cut off(C.0)=0.10+阴性对照平均（NC）A值（如果阴性对照OD值≤0.05按0.05计算，如果阳性对照≥0.05，按实际值计算。 质量控制：3.1空白孔（只加显色剂和终止液）的吸光度值应不大于0.08； 阳性对照（PC）A值大于0.03； 阴性对照平均A值小于0.08；如果质控是有效的，试验结果就是有效的。 结果判定：阴性结果：标本吸光度值临界值为阴性；阳性结果：标本吸光度值临界值为阳性。 五、临床意义： TORCH系列中的四种微生物都可通过胎盘影响胎儿早期的正常发育并引起多种先天性疾病。如 TOXO导致先天性弓形虫病，引起胎儿死亡或畸形；目前流行饲养宠物，如猫等，弓形虫可因人们接触了含有卵囊的猫粪而传染，这也许是近年来弓形 体病发病率增高的因素之一。 RUB 是一种呼吸道病毒其传播途径主要为呼吸道，通常只引起轻度的青春期疾病，但是，孕妇在妊娠早期感染 RUB 可使胎儿患先天性风疹病，导致胎儿慢性心脏病，发育迟缓，肝脾肿大，畸形和其他严重异常。