时间分辨免疫荧光分析课件.ppt

时间分辨免疫荧光分析（Time－resolved fluoroimmunoassay TRFIA） 2008 主要内容 TRF发展史、原理、特点、标记物 TRF与现有检验方法的比较 TRF反应模式的选择 TRF标记物的制备纯化 TRF的实验室操作 标记免疫方法 ⑤时间分辨免疫荧光 影响免疫学分析灵敏度的因素（一） 抗原-抗体间反应的亲和性－影响分析灵敏度的最根本因素。 理论上说，竞争免疫分析的抗体用量越少，分析灵敏度越高；非竞争免疫分析（测量抗体结合位点被占据的部分），抗体用量越多，分析灵敏度越高。 对于竞争免疫分析，反应的亲和性和操作误差为决定分析灵敏度的主要因素。Sensitivity（max）＝a/k a为操作误差，k为免疫反应平衡常数 由于a一般难以低于1％（a0.01）而k一般小于1012 l/mol ,所以竞争免疫分析在理论上最高灵敏度应低于10-14 mol/l 影响免疫学分析灵敏度的因素（二） 信噪比是非竞争免疫分析分析灵敏度的决定因素。（高亲和性抗体、高比活性的标记物，增加Ab量，降低标记抗体的非特异性吸附有利于提高信噪比） 由于竞争分析和非竞争免疫分析不同的原理（分别为测量抗体结合位点的空余部分和被待测物占据的部分），使得后者的潜在灵敏度比前者高2－4个数量级。 Ab的亲和性是影响免疫分析灵敏度的最根本因素，决定了免疫分析能达到的最高灵敏度，免疫分析其他条件的优化都是为了接近这一个灵敏度。 标记免疫技术的理论检测灵敏度比较 TRF发展史（一） 1979年，芬兰SOINI和HEMMIA提出了“时间分辨荧光免疫分析”理论， 1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术。 1985年，时间分辨荧光仪和 TSH、T4等多种商用试剂盒陆续问世 1989年，时间分辨荧光分析技术获诺贝尔化学奖提名 2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖 TRF发展史（二） 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。已广泛运用它来进行蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针和生物活性细胞的定量分析。时间分辨荧光分析技术正在成为现代临床微量检验、分子生物学、细胞学和生物化学等生物医学研究中最有发展前景的分析手段。 TRF发展史（三） 国内正在致力于将时间分辨荧光分析用试剂盒甚至仪器国产化，虽然因有些关键技术问题未得解决，质量与国外产品有一定差距，但正在国外厂家的帮助下得以改善 理论研究领域，北京的301医院和江苏原子能研究所是最早进行TRF的临床应用研究。近年来，许多研究机构和医院都在TRF的技术和临床应用方面均做了大量工作。国内TRF的临床应用已开始从研究阶段进入大量使用阶段 时间分辨免疫荧光分析标记物 TRF标记物：镧系元素及其螯合物： 镧系元素共有15种，有四种用于TRF Eu铕、Sm钐、Tb锝、Dy镝 单标记中Eu最为常用 双标记中Eu和Sm最常用 镧系元素特性 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝（Tb） 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60-900 us) 铕：714us 普通荧光免疫中荧光团：1-100us 样本中蛋白质荧光：1-10us，易猝灭。 同时由于衰变时间长，Eu3+ 标记物在测量时间里可以反复被激发，使得TRF的荧光标记物相对比活性很高 STOKE’S位移 时间分辨免疫荧光分析 技术原理: TRF利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物,代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系（如：抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。 时间延迟 波长分辨 TRFIA的特点 零本底 灵敏度高 操作简便 示踪物稳定 标准曲线范围宽 不受样品自然荧光干扰 操作可实现全自动化 无放射性污染 多标记（双标记） 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)与放射免疫分析法(RIA)比较 时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）与化学发光分析法（CLIA）比较 TRF技术为临床检测带来的先进性 TRFIA的反应模式 反应模式 双抗体夹心示意图 双抗原夹心法示意图 中和抑制法示意图 固相抗原竞争法(检测抗体) 抗原包被、封闭→加入一抗/检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测。