电化学发光免疫分析法_1课件.pptVIP

* 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。 链霉亲和素包被、生物素化抗体、以增大抗体结合量，达到放大效果。  * 双抗体夹心法 * 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。 * 蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测Ag的含量。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。 * 终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 * * 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）一分子SA可与4分子B相结合。在ELECSYS的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 * * * 甲状腺激素，甲肝，乙肝，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。 * 试剂不开放、检测成本高, 成为电化学发光技术应用的最大障碍 ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合） * ECLIA体系结构图 * ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面） * ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应） * ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠） * 方法评价 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快； * 方法评价 “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高； * 方法评价 利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化； 标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。 * ELIA优越性 高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。 * 临床应用 激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。 * * * * 常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。 * 我国放射免疫分析法有很高的灵敏度，但存在着放射性防护和同位素污染等问题。 * 生物发光和化学发光是自然界中一种普遍现象。 * 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。 * * 化学发光的物质有两种能态，即基态和激发态，前者能级低后者能级很高，一般地说在激发态时分子有很高并且不稳定的能量，它们很容易释放能量重新回到基态，当能量以光子形式释放时，我们就看到了生物发光。 * * 化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式 * 因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了化学发光免疫测定（CLIA）技术。 * CLIA是继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。 * 微粒子化学发光免疫分析（ECIA） 也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。 * 化学发光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是