试剂盒质粒DNA提取原理 质粒DNA提取原理.docVIP

试剂盒质粒DNA提取原理 质粒DNA提取原理 教 案 课程名称 分子生物学实验 授课题目（章、节） 实验七 授课教师 陈永燕 迟彦 授课对象 生物工程031 授课时间 8学时 教学方法 实际操作（分组实验） 选用教具 授课内容提要及时间分配：（8学时） 实验七 质粒DNA的提取 [目的要求] 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术 [实验原理] 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [教学内容] 1． 质粒粒载体基本结构特点介绍 2． 介绍几种质粒DNA提取的方法 3． 碱裂解法提取载体质粒 4． 加入RNA酶去除质粒DNA中的残留RNA [实验材料和用品] 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pUC19、pGEX质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶等。 大 连 大 学 教学重点、难点及基本要求： 掌握碱裂解法提取质粒的原理；I液-III液的作用；提取质粒的注意事项。 作业与思考题： 1. 碱法提取质粒原理? 2. I液-III液作用? 3. 在碱法提取质粒DNA 操作过程中应注意哪些问题？ 4. 质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？ 单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等） 一 相关知识 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 质粒与宿主的关系： 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活。 而宿主即使没有它们也可以正常存活。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control)： 只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 松驰控制型(Relaxed control) ： 在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。 与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因) 一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列, 　 去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。 一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性： （1）分子量小、多拷贝、松驰控制型； （2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点； （3）具有复制起点（4）具有容易操作的检测表型。 抗性基因 （Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene） 启始复制子 （ori, Origin of replication) 多克隆位点 (MSC, Multiple cloning site or polylinker) 标记基因 (Marker gene, such as LacZ gene)。 常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。 二 实验相关 质粒提取原理： SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一