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pH值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响 摘 要 生产中聚谷氨酸的发酵液非常黏稠(粘度达1．71Pa·s)，这使除茵体提取聚谷氨酸非常困难。通过加酸或碱调节发酵液pH5或pH8可明显降低发酵液的粘度(其中pH3．5时粘度仅为pH6．5时的1 60左右)。将pH3．5的发酵液离心除茵(10 000 g，10 min)后超滤浓缩(滤膜孔径0．45,um，平均压力0．08 Mpa)1倍，再加入95％ 乙醇提取7-PGA，与pH 中性时相比，可减少50％ 以上的能量消耗及40％ 的溶剂，但聚谷氨酸损失约10％ 。加酸或加碱处理可使发酵液中7-PGA 的分子结构发生改变，分子质量降低，这对生产高分子质量的聚谷氨酸不利，但对生产低分子质量产物是适宜的。关键词 聚 一谷氨酸，提纯，乙醇沉淀，枯草芽孢杆菌聚7一谷氨酸(7一PGA)是一些芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌等)荚膜结构的主要成分，是一种生物自然合成的聚酰胺原料_8 J。由于7一PGA可完全生物降解，对人体无毒，因此被认为是一种良好的生物可降解聚合物材料，可广泛地应用于食品、医药、环保、化妆品及农业等领域[ ， ， 。在发酵法生产7-PGA方面，国 内外已经有几个研究小组在探索，但在7一PGA的提取方面，研究的人比较少。在芽孢杆菌生长过程中，7一PGA从细胞壁中分泌出来形成菌体的荚膜结构，也可溶解在培养液中。由于7一PGA 属于高分子聚合物，分子质量一般在100 000～1000 000 u之间，因此生产上发酵液变得非常粘稠，这一方面影响通风供氧，增加搅拌阻力，另外也给发酵结束后除菌体提取7一PGA带来很大困难。从7一PGA分子单体的结构来看，分子中有游离的羧基，其等电点为3．47 J，在7一PGA生产中由于发酵液的pH值接近中性，7一PGA荚膜结构带负电荷，在培养液中很稳定，不易沉降。产荚膜细胞的这种较高的稳定性及发酵液的高粘度，是细胞分离和7一PGA提取中存在的突出问题。降低产荚膜细胞的稳定性及发酵液的粘度是解决问题的关键所在。 1 材料和方法 1．1 材料 1．1．1 菌 种 枯草芽孢杆菌B53，从瓜汁中分离得到并进行了鉴定。 1．1．2 培养基和培养条件 (1)种子培养基：胰蛋白胨10 g／L，酵母提取物5g／L，NaCI 10 g／L，葡萄糖1 g／L ，蒸馏水配制，调pH7．2，0．1 MPa灭菌20 min。 (2)发酵培养基：L—Glu 20g／L，CTA 9．86 g／L，Glycerol 80．36 g／L，(NH4)2S04 7 g／L，MgSO4。7H2O0．5 g／L，FeC13 6H20 0．02 g／L，K2HPO4 0．89 g／L，CaCI2 0．03 g／L，MnSO4 H2O 0．3 g／L，蒸馏水配制，用NaOH调pH6．5，0．1 MPa灭菌20 min。基本发酵条件：采用300 mL三角瓶装液量50mL，种子液24 h，接种量4％ (V／、厂)，摇瓶转速150 r／min，37℃ 振荡培养96 h。此条件下可生产20～25 g／L的7一PGA。 1．2 方法 1．2．1 7一PGA 的提取及测定方法7-PGA含量的测定参考文献[1]。 1．2．2 发酵液动力粘度的测定发酵液经离心除菌后(离心转速20 000×g，20min)，采用SNB一1数字式粘度计测定上清液粘度。选用3号转子，转速12 r／min，25℃下测定。 1．2．3 发酵液pH值的测定酸度计法。 1．2．4 超滤方法 采用配备0．2 m、0．45 m 滤膜的小型超滤系统，20～25℃ ，压力0．05～0．10 MPa。 1．2．5 SDS电泳方法 采用DYC 23B型电泳仪(北京六一仪器厂)，分离胶10％，浓缩胶5％，电泳条件为操作电压80V，稳压3h，标准蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，PGA用阿利新兰8GX染色，其他参考文献[9 3进行。 1．2．6 显微观察 采用显微摄像系统(Motic B Series／Panasonic)。 2 结果与讨论 2．1 pH值对PGA发酵液动力粘度及产物回收的影响 取发酵液280 mL，分装8个三角瓶中，用6 mol／L HCI或6 mol／L NaOH分别调pH值为3．0、3．5、 4．0、5．0、6．0、7．0、8．0和9．0，然后在25℃ 及45℃ 下分别测定动力粘度(如图1)。取上述不同pH值的无细胞培养液各10 mL，分别加入95％乙醇25 mL，振荡后离心15 min(10 000×g)，称量沉淀物湿重(一次提纯)，再将沉淀物各加5 mL去离子水溶解，再分别加入15 mL 95％的乙醇，振荡后离心15 min(10 000×g)，再称量沉淀物湿重(二次提纯)。结果如图2所 由试验结果看出，pH值与温度对发酵液的粘度有较大的影响。在