发酵工程在功能性食品中的应用课件.ppt

2.3维生素C的发酵法生产 维生素C，又名L－抗坏血酸，为人体所必需的维生素，并作为许多具有重要生理功能的金属酶的辅助因子，参与胶原蛋白的羟基化、肉碱生物合成、多巴胺羟基化等多种代谢活动。同时维生素C还是一种重要的自由基清除剂，可清除超氧阴离子（O2–·）、羟自由基（OH·）和烷过氧基（ROO·）等，这些自由基被认为与癌症、心血管疾病等密切相关。维生素C广泛用于食品、功能性食品、药品和化妆品中，目前世界总产量每年近80000t，总值超过6亿美元，市场前景广阔。 2.3.1莱氏法工艺 一直为生产维生素C的普遍方法，其基本原理是： D－葡萄糖 H2/Ni D－山梨醇弱氧化醋酸杆菌L－山梨糖丙酮/H2SO4双丙酮－L－山梨糖高锰酸钾双丙酮－L－古洛酸 水解 2－酮基－L－古洛酸 内酯化、烯醇化 L－抗坏血酸 2.3.2两次发酵工艺 由于莱氏工艺路线繁杂冗长，辅助原料消耗量大，自20世纪60年代开始研究重点集中于微生物发酵，希望能将D－山梨醇或L－山梨糖直接转化为2－酮基－L－古洛酸。我国从1969年开始在微生物发酵－化学合成法的基础上进行维生素C的两次发酵工艺的研究，在1974年取得很大成功，筛选得到以氧化葡萄糖酸杆菌为主要产酸菌，以条纹假单胞菌为伴生菌的自然共生菌丝，两者共生发酵时，能L－山梨糖直接转化为2－酮基－L－古洛酸， 省去了莱氏法中的丙酮保护步骤，避免了丙酮、酸、碱或苯等有机溶剂的大量使用，其工艺简单，可节省大量化工原料，安全卫生，三废和污染较小，已为国内大部分厂家采用。 2.3.3生产菌种 将D－山梨醇转化为L－山梨糖的微生物除弱氧化醋酸杆菌，还可用生黑醋酸杆菌。将L－山梨糖转化为2－酮基－L－古洛酸所用的主要产酸菌是氧化葡萄糖酸杆菌，除与条纹假单胞菌共生发酵外，还可与荧光假单胞菌、双黄假单胞杆菌和绿叶假单胞菌等共生发酵。 2.3.4发酵工艺 生产时可直接用葡萄糖或淀粉水解液为原料，经还原葡萄糖成山梨醇。反应结束后，过滤除去催化剂，离子交换除去离子杂质，活性炭脱色，浓缩得到符合要求的山梨醇溶液、将山梨醇溶液泵入内循环气升式发酵罐中。加水调节山梨醇含量至10％～35％，通常在发酵初期浓度较低，待菌体繁殖至对数期再提高含量。接种弱氧化醋酸杆菌进行发酵，调pH6.2～6.8，温度28～30℃，罐内压力0.02～0.1MPa，通气量0.6～1vvm，罐内装填率70％～80％。 经14～30h发酵结束，山梨醇得率可达96.5%，培养基组成（略）。第一次发酵结束后，将发酵醪升温至80℃保持10min灭菌，补充所需原辅料，调pH6.7～7.0，接种氧化葡萄糖酸杆菌和条纹假单胞菌，在30℃温度下进行共生发酵。为保证产酸的正常进行应定期补充碱维持pH7.0。经20～36h，将山梨糖耗尽，发酵达到终点。 发酵结束后，过滤或离心除去菌体蛋白，发酵液经静置、澄清、离子交换、浓缩、干燥后可得2－酮基－L－古洛糖酸晶体，再经后续的化学合成阶段得到终产品维生素C，总得率为44.5%～46.7%。共生发酵种子和发酵罐培养基（略） 2..3.5发酵法生产维生素C的研究进展 ⑴ 2－酮基－L－古洛糖酸转化率的提高 L－山梨糖生物氧化成2－酮基－L－古洛糖酸是由细胞膜界面或细胞内的山梨糖酮脱氢酶所催化，生成L－山梨糖酮中间体，进入细胞质，然后经胞内脱氢酶进一步作用，在细胞质山梨糖酮还原酶和山梨糖还原酶作用下生成木酮糖，进入磷酸戊糖途径，生成6－磷酸葡萄糖，进入糖醛酸途径，生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP葡萄糖醛酸），再经糖醛酸还原酶催化， 以NADPH为氢供体还原成L－古洛糖酸，然后由内酯酶催化脱水形成L－古洛糖酸内酯，最后由L－古洛糖酸内酯氧化酶氧化成抗坏血酸。灵长目动物和人因为缺乏L－古洛糖酸内酯氧化酶，故不能合成抗坏血酸，而大多数动植物都具有这一途径。在这一途径中， UDP-葡萄糖醛酸在差向异构酶催化下，C5上的基团差向异构，生成UDP-艾杜糖醛酸。 国外有研究将李氏醋杆菌细胞膜界面上的山梨糖酮脱氢酶基因，在含细胞质山梨糖酮脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌中表达，使L－山梨糖氧化为2－酮基－L－古洛糖酸的转化率提高35％。 在发酵过程中，由于UDP-艾杜糖醛酸的生成，导致2－酮基－L－古洛糖酸的产量下降。通过化学诱变，可使UDP-艾杜糖醛酸的合成数量大幅度减少，从而提高2－酮基－L－古洛糖酸的得率。另外，也有人提出通过2,5–二酮基–D–葡萄糖酸途径，来合成2－酮基－L－古洛糖酸。 先由欧文氏菌突变株将D－葡萄糖转化为2,5–二酮基–D–葡萄糖酸，然后将整个培养基经十二烷基硫酸钠处理以降低细胞活力，再加入葡萄糖，最后经棒状杆菌变异菌株作用生