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碱性磷酸酶提取与纯化The Separation and Purification of AKP
* * 碱性磷酸酶的提取与纯化 Exp.4 Extraction and Purification of Alkaline Phosphatase (AKP) （目的要求） 掌握用有机溶剂分离、纯化酶的原理和方法 Purpose Master the principle and method of preparation and purification of enzyme by organic solvent 有机溶剂（乙醇、丙酮、正丁醇等）通过降低酶的S而使酶沉淀析出 降低介质的介电常数及对酶蛋白的脱水作用 （原理） Principle 33% dissolve 50% pellet 30% dissolve 60% pellet ice acetone （冷丙酮） ice ethyl alcohol （冷乙醇） 所用试剂的作用： 30% AKP溶解 60% AKP沉淀 乙醇 33% AKP溶解 50% AKP沉淀 丙酮 使部分杂蛋白变性 正丁醇 保护和稳定AKP的作用 Mg(Ac)2 低渗破膜 NaAc(低) 作用 试剂 注意事项： 防止酶失活！ ①低温 ②慢慢滴加有机溶剂，并边加边充分搅拌 ④短时离心 ⑤ 沉淀\上清液 （弃、留 ） ③ 各步加入有机溶剂量的计算要准确！ （操作） 一次过滤,五次离心: 取10ml肝匀浆于三角烧瓶内 加入2.5ml正丁醇，！充分搅拌3~5min 室温置10min，滤纸过滤 滤纸不要用水打湿 ！！ 注意 滤液（约4ml） 观察并记录现象 加等体积冷丙酮，立即搅拌混匀！3500rpm，5min 上清 （弃去） 沉淀 慢慢滴加，边加边搅 Methods (一) （操作） 沉淀 加4ml 0.5M Mg(Ac)2溶液,搅拌,记录体积V1,留取0.2ml测活性 B液,记录V1 0.2ml B液 B1液 加1.8mlTris 悬液(V1′) 加96%乙醇至30%,立即搅拌混匀！ 3500rpm, 5min V=0.45(V1-0.2) 沉淀 （弃去） 上清(V2) 记录V2 加96%乙醇至60%,立即搅拌混匀！ 3500rpm, 5min V=0.83V2 上清 （弃去） 沉淀 Methods (二) 沉淀 加3ml 0.5M Mg(Ac)2溶液,搅拌,记录体积V3, 加丙酮至33%, 3500rpm,5min 记录V3 V=0.5V3 上清(V4) 沉淀 （弃去） 加丙酮至50%,立即搅拌混匀！ 3500rpm, 5min 记录V4 上清 （弃去） 沉淀 加2ml Tris缓冲液,搅拌 C液 V= V4 1 3 观察并记录现象 留取C液 Methods （操作） (三) (结果) （上交B1和C液保存） Results 记录(V1-V4)的体积及各有机溶剂所加的量 (以表格形式) Save B1 and C solution！ AKP溶液 ml ml 有机溶剂 V1 V2 V3 V4 VC V1， V2， V3， V4， 记录体积 *
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