第十二节 高效液相色谱.ppt

第 十二 章高效液相色谱 (HPLC) 概述 第一节液相色谱柱效 第二节高效液相色谱仪 第三节分配色谱 第四节液固吸附色谱 第五节其他色谱分析 三、分离类型选择 四、 HPLC的应用  2. 稠环芳烃的分析 3 流动相(洗脱剂) 越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。 溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能 溶剂强度参数 硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯 流动相： 干燥正庚烷 1份水饱和的正庚烷 2份干燥正庚烷 水饱和的正庚烷 改变流动相的 组成可改变分离 的选择性 4 应用 ?具有不同官能团的化合物 ?具有相同官能团，但数量不同的化合物 ?异构体 例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序： 邻位间位对位 邻硝基苯胺 间硝基苯胺 对硝基苯胺 适合分离的物质 一 离子交换色谱法 阳离子交换树脂 阳离子交换 阴离子交换 1 分离原理 2 固定相 阳离子： －SO3H(强) －CO2H(弱) 阴离子： －N+R3(强) －NH2 (弱) 基质 合成树脂 纤维素 硅胶 离子交换剂 3 流动相 水相缓冲液+有机改性剂 调节选择性的主要参数 盐种类及浓度 pH值 各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序： 用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快 3 贮液瓶及流动相 1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。 对流动相溶剂的一般要求 二 进样系统 取样和进样功能 手动和自动 要求： 密封性好 死体积小 重复性好 进样时对色谱系统的压力和流量波动小 二 进样系统 准备状态 进样状态 ?六通阀进样 装置 ?自动进样器 三 色谱柱 内径：4～5 mm，柱长：10～50 cm； 柱填料粒径3 ～ 10μm 分离柱 干法 填料粒度＞20μm时 湿法 颗粒＜20μm时 色谱柱的填充 匀浆法装柱示意图 四 检测系统 溶质型检测器 总体检测器 示差折光检测器 介电常数检测器 紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器 1 紫外吸收检测器 (a) 可变波长紫外检测器 (b) 二极管阵列检测器 氘灯 光栅 流通池 测量光电二极管 参比光电二极管 2 二极管阵列检测器 两种检测器的色谱图 (a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器 (b) (a) 紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。 一些常用溶剂的紫外截止波长 205 甲醇 190 乙睛 212 四氢呋喃 210 苯 187 245 380 紫外截止波长 /nm 水 氯仿 CS2 溶剂 3 荧光检测器 ?灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。 4 示差折光检测器 ?利用组分与流动相的折射率之差进行检测。 ?通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。 5 化学发光检测器 6 电化学检测器 电导检测器 安培检测器 7 质谱检测器 五 检测系统 脱气装置 梯度洗脱 再循环 恒温 馏分收集及处理 分离原理 K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关 液液分配色谱 液液色谱 键和相色谱 通过物理吸附的方法将液相固定液涂在载体的表面 通过化学键合方法将液相固定液涂在载体的表面 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。 缺点 特点 固定液溶液流失 一、化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； 硅胶为基体，利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子之间成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类 （1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等； （2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等； （3）离子交换基团 如阴离子交换基团：胺基，季铵盐；阳离子交换基团：磺酸等。 键和类型 键合方法 （l）硅酸酯型（≡Si一OR）键合相，适用于不含水或醇的流动相； （2）硅氮型（ ≡Si一N=）键合相，可用于非极性或强极性的溶剂作流动相，当使用水溶液时，必须限制pH在4?8范围内； （3）硅碳型（ ≡Si一C ≡）键合相，同硅氮型； （4）硅氧烷型（ ≡Si一O一Si一C ≡）键合相，具有热稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂，能在70?C以下，pH在2?8范围内正常工作。 2. 键合相色谱法分类 ?反相键合相色谱: 常用固定相：C18 分离对象 非极性 中等极性化合物 常用流动相 甲醇-水 乙腈-水 反相键合相色谱 疏溶剂分离机制 固定相极性流动相