第五节第三节——五电泳分离.ppt

影响SDS-蛋白质结合的因素 1.溶液中SDS的浓度 2.样品缓冲液的pH、离子强度 3.二硫键是否完全被还原 （二）、操作 凝胶浓度根据待测样品分子量大小决定，凝胶用含0.1%SDS的0.1M磷酸缓冲液配制，ACR：Bis=29：1。 1、凝胶浓度的选择 2、样品制备 样品溶于含1%SDS、0.1%巯基乙醇的0.01M磷酸缓冲液中。上样前置100oC水浴中密闭煮2-5min。 3、电泳条件 电极液为含0.1%SDS的0.1M磷酸缓冲液。 4、固定与染色 Tissue preparation 源组织 微量离心管 溴酚蓝 旋涡 Preparing acrylamide gels 浓缩胶/分离胶配置 Preparing acrylamide gels 异丙醇（水） Electrophoresis 电泳缓冲液 Electrophoresis 染色 银染法 考马斯亮蓝染色法 Gel Blue Coomassie Coomassie solution 考马斯亮蓝溶液 SDS凝胶电泳扫描与染色图谱 M S S S1 M S1 M S2 S2 （三）蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的计算 蛋白质分子量的计算1.要求有一组标准蛋白质，其分子量应包含欲测分子的大小。2.欲测分子的性质、构形与标准分子类似。3.标准蛋白与被测分子在同一块凝胶上电泳。 4.以标准样品的迁移率作横坐标，相应分子量的对数作纵坐标，绘制标准曲线。 lgM= a - bRf Rf= 蛋白质迁移距离 溴酚蓝迁移距离 Migration of proteins in SDS gels of varying acrylamide concentrations (%T). 9个蛋白质：分子量94 kDa ——14.4 kDa Electrophoresis Theory , Methods and Aplications 五、电泳技术 电泳的概念 电泳是指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。 分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。 方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。 电泳的特点 一、基本原理 当带电粒子以速度ν 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。 （一）基本原理 电泳阻滞力 电场强度 物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。 （二）影响电泳速度的相关因素 颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。 电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快； 离子强度在0.02－0.2为宜; 泳动速度与溶液黏度成反比。 - SO4 - SO4 - SO4 - SO4 COO - Na+ Na+ 吸附的反离子 固定基团 ＋ — 4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 5.焦耳热 电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率，严重时甚至烧断或熔化支持介质。 6.筛孔 在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速度快。 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ） 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点及分子构型。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。 1. 聚丙烯酰胺凝胶的合成 丙烯酰胺 N,N-甲基双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶 催化剂 聚合反应 凝胶 丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定 烯溶液 浓溶液 交联剂 结点 TEM(投射电镜) image of a polyacrylamide(聚丙烯酰胺) 2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 （1）化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。 pH：在碱性 pH 时，反应速率高；而在酸性条件时