柑橘溃疡病菌中用GFP标记蛋白质亚细胞定位：以分裂隔膜为目标.docVIP

柑橘溃疡病菌中以分裂隔膜为目标作为GFP标记的蛋白质的亚细胞定位 读 书 报 告 专业 ：应用微生物 学号 :112011325001861 姓名 :左佩佩 目录 摘要 - 2 - 引言 - 2 - 材料和方法 - 4 - 细菌菌株和培养基 - 4 - 一般方法 - 4 - 病原性实验 - 6 - 荧光显微法 - 7 - 结果 - 7 - Xac中蛋白质表达载体的构建 - 7 - 表达系统显示稳定的整合到Xac染色体上 - 8 - 破坏amy基因座不改变Xac的毒力 - 9 - Xac中蛋白质的亚细胞定位 - 12 - 讨论 - 16 - 柑橘溃疡病菌中以分裂隔膜为目标作为GFP标记的蛋白质的亚细胞定位 摘要 柑橘溃疡病菌（Xac）是产生柑橘癌症的原因，是影响全世界柑橘的一种重要的疾病。为了了解Xac的重要生物学过程的特点，我们构建了在这种细菌中用绿色荧光蛋白（GFP）标记的蛋白质异位表达的整合质粒。我们指出α-淀粉酶基因（amy）的破坏-质粒整合到细菌染色体上的位点，没有改变细菌的病原性，然而完全破坏了Xac降解淀粉的能力。进一步说，GFP表达系统被用来描述ORF XAC3408的特点，通过Xac编码的假设蛋白质，这个蛋白质与枯草芽孢杆菌中的FtsZ稳定因子ZapA具有明显的同源现象（ZapABsu）。Xac中表达的GFP- XAC3408显示了GFP-ZapABsu一个典型的隔膜定位类型，这个表明XAC3408是细胞分裂蛋白ZapABsu的Xac直系同源基因。这个结果显示Xac中用GFP标记具有功能特点蛋白质的潜力，另外，在隔膜处标记的Xac突变株构成一个生物模型，为了检测抗菌化合物抑制植物病原体细胞分裂。 关键词 ：柑橘癌症；细胞分裂；α-淀粉酶 引言 柑橘溃疡病菌是革兰氏阴性菌，是影响大部分柑橘属的植物病原菌，并且是成为植物癌症的原因，对全世界来说是柑橘属植物的一种非常重要的疾病。不存在有效控制这种病的方法，更加详细了解生物病原性机理可能在实质上形成预防和控制感染的方法。完成这个任务的主要工作是阐明Xac的基因组序列，基因组序列已经促进利用Xac作为模式微生物进行大量的分子研究，然而，没有合适的技术方法可以促进蛋白质组检测。 我们主要集中研究Xac的某些重要生物学过程的特点，在染色体分离和细胞分裂中包括的更加特殊的生物学过程。这个细菌系统的一个共同的特点是这个细菌系统经常有蛋白质构成的，这些蛋白质与在许多衍生的真核生物中与他们功能相似的蛋白质具有很少的同源性；因此，这些蛋白质构成抗菌药物形成和病原控制构成完美的目标。然而，为了在Xac中着手进行蛋白质功能研究，我们为这个目的缺少发展的和/或者可利用的生物学功能。 我们描述了Xac中一个蛋白质表达系统，这个也能够被用于这个病原体中用绿色荧光蛋白（GFP）标记因子的亚细胞定位。我们利用这个系统来描述Xac中假设蛋白质的特点，这个蛋白质与FtsZ稳定因子ZapA具有明显的同源性，FtsZ稳定因子ZapA最初在枯草芽孢杆菌中被描述（ZapABsu）。此外，我们指出α-淀粉酶基因的破坏，质粒整合到染色体上的位点，没有改变细菌的发病机理。 材料和方法 细菌菌株和培养基 利用的是以被测序的柑橘溃疡病菌菌株，以前特指的柑橘溃疡病菌菌株306（IBSBF 1594）。大肠杆菌菌株DH10B被用于克隆。大肠杆菌利用LB/LB琼脂培养基在37℃条件下培养；Xac利用营养琼脂酵母甘油（NYG）/NYG琼脂培养基在30℃条件下培养。分别加入20和10μl mL-1的氨苄青霉素和卡那霉素。对于α-淀粉酶检验，在NYG琼脂培养基中加入0.2%的可溶性淀粉；在细菌生长以后，把培养基曝光在碘晶体形成的水蒸气中，在培养基上形成环。 一般方法 利用Amaral等描述的方法进行Xac的电转化。寡核苷酸在支持信息，表S1中被列出。通过几个DNA盒的有序连接构建整合的GFP表达载体（图1）。首先，通过两个合成的寡核苷酸经退火形成一个含有57bp的双链（ds）DNA，两个合成的寡核苷酸：核糖体结合位点（RBS）（顶部和底部）。这个dsDNA含有RBS，并且含有HindⅢ兼容的末端。这个双链DNA被连接到pUC18/HindIII (NEB)，形成pTAS1。用EcoRI/HindIII对pTAS1进行酶切，与木糖启动子和它的抑制DNA (xylR-pxyl)相连接，形成pTAS3，这两个基因都是从pEA18中分离的，也用EcoRI/HindIII进行酶切。产生的pTAS3，用BamHI/XbaI进行酶切，与gfp基因连接，（位于BamHI/XbaI的侧面），因此，形成pPM1（来自pEA18的gfp利用引物GFP_WO_STOP/GFP_F_C-ter 进行PCR扩增）。因为Xac本身对氨苄青