2第二章基因克隆载体的种类和特性 生命中的螺旋结构.pptVIP

第二章 基因克隆载体的种类和特性 基因工程的基本条件 A 目的基因 （从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和扩大繁殖获得足够量的目的基因或cDNA序列） B 用于基因克隆的载体 （合适的载体，并对载体DNA进行克隆，制备足够量的达到一定纯度的载体DNA） C 用于核酸操作的工具酶 D 用于基因转移的受体菌或细胞（宿主细胞） （能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞） 一、载体的功能、特征及种类 载体（vector)：携带外源基因(或DNA片段)进入受体细胞（复制、整合或表达）的工具。 使用载体的目的 基因的复制扩增 基因的表达 基因的整合 基因的调控 其他 1、载体的功能 （1）运送外源基因高效转入受体细胞 （2）为外源基因提供复制能力或整合能力 （3）为外源基因的扩增或表达提供条件 2、载体应具备的条件 （1）具有对受体细胞的可转移性 （2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 （3）长度尽可能小，以提高其载装能力 （4）具有多种单一的核酸内切酶切割位点(Multiple Cloning Site,即多克隆位点，MCS） （5）具有合适的选择性标记 3、载体的种类 （1）质粒（plasmid）载体（又可分为：克隆载体、中间载体、穿梭载体和表达载体） （2）噬菌体（phage）载体 A、λ—噬菌体 B、考斯质粒（粘性质粒）（cosmid) C、M13—DNA（单链丝状噬菌体） （3）酵母人工染色体载体（YAC） （4）细菌人工染色体载体（BAC） （5）其他载体 4、载体的要求 独立复制 可插入外源片段 易分离，易操作 二、质粒（plasmid) 1、质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、闭合、环状双链DNA分子（Covalently closed circular DNA, ccc DNA)，质粒是一类引人注目的亚细胞有机体，其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。 2、它并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。质粒类型多种多样，有F质粒也叫性质粒；有编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒，R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力；有产生大肠杆菌毒素的Col质粒等。 3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA质粒。质粒DNA的大小：文献中有3种说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD 质粒DNA分子量范围：一般在1-200kb之间,多数10kb左右 质粒常见于原核细菌和真菌中 发展概况 1.?第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.?第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 质粒载体是上世纪70年代实验室普遍使用的基因克隆载体。 （一）质粒的生物学特点 1、自主复制性(Self-replication)： 2、相容性和不相容性(incompatibility) ： 3、可转移性： 1、质粒的自主复制性： 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受寄主细胞染色