犬小孢子菌课件.ppt

犬小孢子菌SSH文库中差异基因的研究 硕士研究生：张渊 指 导 教 师：杨国玲 教授 专 业 名 称：皮肤病与性病 前 言 犬小孢子菌主要侵犯儿童 引起白癣、脓癣和体癣 儿童头癣48% 材 料 前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆 主要试剂： 1. DIG High Prime LabelingDetection Starter Kit I 2. 杂交膜 3. Real time PCR Kit 主要仪器： 1. CL1000紫外交联仪（UVP） 2. Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System 阳性克隆测序 阳性克隆菌液送大连宝生物测序：菌种为DH10B，载体为PMD-T18 测序使用引物为：F Primer（M13-47）；R Primer（RV-M） 测序分析 探针引物序列 阳性克隆测序及分析 消减文库1差异基因比对结果 消减文库2差异基因比对结果 蛋白功能分类 实时PCR--18s rRNA 4个ESTs表达的相对表达倍数关系 讨 论--FSH1 目前对FSH1的研究主要是对其结构的分析 FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物 FSH家族功能较多：蛋白酶作用 、调控因子作用等 FSH1在此发挥蛋白酶作用还是调控因子作用还不清楚 讨 论--PQ-LRP PQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重复的环结构 （环1和环2） 环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要 半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢 PQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强有关 PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子 讨 论--NADH1 NADH1是呼吸链的组成部分，参与ATP的生成 犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能与其在儿童头皮组织中生长更活跃有关 讨 论--P-GAL4 P-GAL4基因属于GAL4家族，含有一个真菌中独有的GAL4域 GAL4家族普遍的功能是转录调节，主要调控氮源代谢、生殖繁殖等 在本研究中，P-GAL4基因在此可能是调控真菌的生殖，导致犬小孢子菌在儿童的头皮组织中大量繁殖 ，导致头癣的发生 结 论 SSH1文库得到5个差异基因： 1. FSH1 2. PQ-LRP 3. multidrug resistance protein MDR 4. RING zinc finger protein 5. RING zinc finger protein, putative 结 论 SSH2文库3个差异基因： 1. P-GAL4 2. NADH1 3. DNA-directed RNA polymerase I subunit 结 论 FSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致头癣的发病机制中起重要作用 P-GAL4和NADH1基因可以作为研究犬小孢子菌致头癣的候选基因 致 谢 导师杨国玲教授 张振颖老师 大连理工大学金礼吉教授 师姐张芙蓉 全体皮肤科老师 * * 儿童体癣36% 成人头体癣16% 研究背景 1.儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用 犬小孢子 菌儿童头癣 发病机制 推测儿童头皮是否诱导 犬小孢子菌毒力因子 ？ 儿童头皮 培养菌株 (tester) 儿童光滑皮肤 培养菌株 (driver1) 成人头皮组织 培养菌株 (driver2) 斑点杂交 实时PCR 技术路线 获得差 异基因 前期完成试验 消 减 文 库 SSH 方法---斑点杂交 正反向 消减文库 PCR扩增 制备探针 酶切回收 杂交膜 DIG-High Primer 探针 菌液PCR产物 序列预处理 去除混杂基因 同源性比对 功能分类 实时PCR Tester mRNA Driver1 mRNA Driver2 mRNA 2个 基因 2个 基因 18S rRNA 3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA 结 果—消减文库酶切前后结果 结 果---斑点杂交 消减文库1斑点杂交部分结果 正向 反向 正向 反向 消减文库2斑点杂交部分结果 结 果---斑点杂交 共得到106个有效序列 共得到13个ESTs 8个ESTs找到了同源基因 6个同源基因具有功能分类 18s rRNA基因在3个RNA池中的实时PCR表达情况 FSH1基