多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用课件.ppt

5. 质谱检测肽端的标签和含量差异 Methods Advantage 双向凝胶电泳技术对疏水性蛋、分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量很低的蛋白难于分离或不能分离，而对于这些蛋白使用基于液相色谱及质谱技术的相对与绝对定量同位素标签技术（Isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）能够得到有效的克服。 在保留转录后修饰的状态下能够分辨更多的蛋白 2. 能同时比较多组样品，目前最多可在相同分离条件下同时比较8组样品 3. 可以对特定的目的蛋白做绝对定量或相对定量 4. 对于实验的定量由于能同时分析多组样品而增加实验统计的相关性。 5. iTRAQ 试剂几乎可以与样本中的所有蛋白结合，容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染． 此外，目前 iTRAQ 试剂仍非常昂贵，这也一定程度制约了它的广泛应用 iTRAQ 技术引入到抗菌肽的研究中．他们使用 iTRAQ 结合多维液相色谱和串联质谱联用技术,研究经最小抑菌浓度下的人源中性白细胞抗菌肽 HNP-1 处理后大肠杆菌的细胞变化．研究结果表明，一些参与糖酵解过程的蛋白酶含量丰度降低了.相反,许多蛋白如 AceE、AcnB 经 HNP-1 处理后含量丰度都显著提高了，而这些蛋白很有可能与抑制反应的补偿性应答有关． 他们认为，这些蛋白含量丰度的增加或降低可能是由于抗菌肽的抗菌作用而引起．所以，这些蛋白可以作为筛选更具抗菌活性的抗菌肽的靶蛋白． Application example 利用iTRAQ 技术处理了猪肝细胞中的1476 种蛋白对其中880 种蛋白进行分析，在错误识别率小于 5% 条件下,他们发现一些与能量代谢、分解代谢、生物合成、电子传递、氧化还原酶类反应等有关的蛋白含量都大大增加了，这些蛋白在肝脏作为化学和能量工厂这一角色中都起着重要的作用． iTRAQ 技术鉴定了芸苔属植物保卫细胞中的相对蛋白成份． 他们用相对定量的方法在经脱落酸处理过的样品中和对照组中鉴定出 431 种蛋白质．在含量丰度相对上调的 66 种蛋白质中，与应激和防御有关的蛋白占大多数． 38 种蛋白的含量丰度下调了，其中许多都与新陈代谢和蛋白合成有关． 也未曾有人报道过这些蛋白与脱落酸敏感或与气孔的开合有关． 他们的研究不仅建立了一个完整的脱落酸敏感蛋白库，而且鉴定出几种新的蛋白，为后续研究其在植物保卫细胞中的功能奠定了基础 Application example 将iTRAQ 技术引入了胃癌抗药性机制的研究中．他们以抗长春新碱的 SGC7901 /VCR 细胞系和其亲本细胞系SGC7901为 研究对象,使用iTRAQ结合LC-MS/MS技术进行分析,共发现820种蛋白质,其中91种蛋白在SGC7901/VCR和SGC790中表达有差异 iTRAQ 技术研究了经鸟枪法处理后的无胰蛋白酶和部分含有胰蛋白酶的多肽，来比较正常的和实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠腰部脊髓的蛋白酶组成变化.他们发现了许多蛋白质如: α1-巨球蛋白(一种蛋白酶抑制剂) α1B-糖蛋白、β2-微球蛋白、染色光多肽、硫化糖蛋白1等． 分别用免疫耗竭和蛋白均衡器去除高分度蛋白技术将血浆蛋白进行预处理.随后用8杯的iTRAQ 技术进行标记，最后用强阳性离子交换树脂结合液相色谱和质谱联用技术分析． 研究结果表明，两种预处理方法在识别蛋白数量上是互补的.好的色层析技术对于进一步分离经 iTRAQ 标记的多肽是非常重要的.两种预处理方法各自识别出 320和 248 种不同的蛋白，其中包括大量的生物功能蛋白和动态范围在 107内的蛋白 Application example Prospect 国内结合多维液相色谱和串联质谱的 iTRAQ技 术 也 以 其 独 特的优点得到了比较广泛的 应用iTRAQ 技术虽然还有一些缺点和不足之处，但该技术在生命科学领域的中的应用价值已凸显，该技术必将在未来的蛋白质组学研究中得到更加广泛的应用，为进一步了解蛋白质在生命过程中的动态变化做出积极巨大的贡献 研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来在体内和体外同位素标记基础上用多维液相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一 Introduction 相对和绝对定量同位素标记( isobaric tags for relati