粘质沙雷氏菌脂多糖的提取课件_1.ppt

粘质沙雷氏菌脂多糖的提取 实验目的 1、了解脂多糖（LPS）的生理生化作用及其制品的应用； 2、掌握从粘质沙雷氏菌中提取LPS的主要方法。 3、掌握真空冷冻干燥机的使用方法。 实验原理 一、菌种 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目，肠杆菌科，沙雷氏菌属。 它是细菌中最小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列成短链，能运动，有4条或更多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽孢。革兰氏染色呈阴性。 粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界中分布很广，分布于土壤、水和食品中，也存在于人的呼吸道、肠道和粪便中。所以该菌可自土壤、水、人和动物的粪便中分离得到。 该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺炎、泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科术后创伤感染，是医源性感染的重要条件致病菌。 约半数菌株能产生红色的灵菌素，多次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失。 二、灵菌素（prodigiosin） 灵菌素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，是一些放线菌、沙雷菌及其他细菌的次级代谢产物， 具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。 灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖(LPS) 同时它还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能。 灵菌素可单用或与抗菌药物联合应用于急性或慢性细菌感染、某些病毒感染；对复发性口疮有效率在90％以上；治疗慢性盆腔炎、慢性附件炎有较好的近期疗效，与抗生素合用可提高治疗效果； 三、LPS的提取方法 目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析法、热水提取法和热酚水法。 先用三氯乙酸、稀醋酸或酚将其提出，再纯化。 冷冻干燥：制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低温脱水的目的，此过程即称为冷冻干燥（Freeze-drying），简称冻干。 冻干工艺包括预冻、升华和再干冻三个分阶段 冻干的固体物质由于微小的冰晶体的升华而呈现多孔结构，并保持原先冻结时的体积，加水后极易溶解而复原。 制品在升华过程中温度保持在较低温度状态下，因而对于那些不耐热的物质，诸如酶、激素、核酸、血液和免疫制品等的干燥尤为适宜。 干燥的结果能排出95~99%以上的水份，有利于制品的长期保存。制品干燥过程是在真空条件下进行的，故不易氧化。 仪器和药品 1、仪器与器皿 离心机、天平、恒温培养箱、摇床、水浴锅、冻干机、湿热灭菌锅。 三角瓶（50 ml、250 ml）、离心管、玻璃棒、烧杯、可调式移液器（1000-1000 μl、1-5 ml）、可调式移液器枪头。 广泛pH试纸、塑料布、透析袋。 2、药品 牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、生理盐水、苯酚、无水乙醇、NaHCO3、EDTA。 实验步骤 1、菌种培养 ⑴斜面培养基培养。 将营养肉汁琼脂培养基[（g/L）：（蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl 5.0，琼脂15.0，PH 值7.0左右）]制作成斜面培养基，将菌种接种在斜面培养基上，28 ℃恒温培养24～48 h。 ⑵发酵培养基培养。 制作营养肉汁培养基分装于三角瓶中，28 ℃恒温160～170 r/min摇床培养24～48 h。 2、热酚水法提取灵菌素 ⑴将深层发酵后获得的菌体以10，000 r/min离心20 min，收集菌体。（先称量一下离心管的质量） ⑵将菌体悬浮于蒸馏水中（每1g细菌加3ml蒸馏水进行悬浮），-40 ℃冰箱反复冻融2~3次效果比较好。 ⑶再加热至60 ℃，在热细胞悬浮液中加入等体积预热至50 ℃的90 %（w/w）苯酚溶液，于68～72 ℃水浴中搅拌保温30 min后，冷至室温。 ⑷4 ℃冰箱中过夜。（处理透析袋100 ℃ 煮30 min） （周一） /// ⑸然后7，000 r/min离心20 min，取水相。 ⑹将水相溶液装于透析袋中，流水透析24 h去酚。（周二）/// ⑻再用蒸馏水透析48 h，每天换水数次。 ⑼将透析袋中的液体装入能预先称重的冻干瓶中，-40 ℃冰箱冻成冰后，置于冻干机中冷冻干燥，得脂多糖粗制品（脂多糖在制成干品前还是后进行除菌由同学选择，并进行相应的操作）。 并做脂多糖抑菌实验的准备工作：找出所需要的仪器、试剂及器皿、配制培养基（周四） /// 3、设计并进行脂多糖抑菌实验 （周五） 写出实验步骤 实验结果 1、根据实验结果计算出LPS的产率。 2、写出LPS的抑菌效果。 思考题 1、在细菌悬浮于蒸馏水之后，为什么最好反复冻融2-3次？ 2、制备好的LPS如果暂时不用，应该怎样保存？ * * 生命科学学院 汪春蕾 *