外科学(骨外)专业毕业论文 [精品论文] 人脐带wharton胶中间充质干细胞生物学特性及组织工程软骨体外构建的实验研究.doc

外科学(骨外)专业毕业论文 [精品论文] 人脐带Wharton胶中间充质干细胞生物学特性及组织工程软骨体外构建的实验研究 关键词：种子细胞 脐带Wharton胶 基质成分 关节软骨损伤 诱导培养 摘要：关节软骨损伤是关节外科常见的疾病.软骨由于其自身的解剖特点，损伤后很难自愈，这也是导致关节疾病和关节不稳的主要原因。目前，关节镜下盥洗术、微骨折技术、马赛克移植术等治疗方法远期效果均不满意，最终导致关节软骨的退变和骨性关节炎。采用自体软骨细胞移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)能够实现透明软骨或透明样软骨修复，并取得较好的临床疗效。但ACI的缺点是供区出现新的缺损，需要二次手术，增加患者的痛苦。采用干细胞移植治疗软骨缺损是一个新兴的治疗手段，并认为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是最有希望的干细胞。MSCs是具有自我复制和多向分化潜能的一类多能干细胞。目前，MSCs主要来源于骨髓，但获得骨髓时造成患者的痛苦，且骨髓源性间充质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代BMSCs，并可弥补其缺陷干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)尚存在定向分化和纯化的技术障碍，且面临众多伦理、法律方面的问题，也有移植后形成畸胎瘤的报道，应用受到一定限制。脐带属于胚胎外组织，是胎儿分娩后的废弃物，组织来源广泛，无伦理学限制。脐带由脐带外膜、脐动脉、脐静脉以及血管周围的黏蛋白样组织，后者被称为Wharton胶。 本研究目的为探讨脐带Wharton胶中干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性，并从四个方面进行阐述。第一部分为人脐带Wharton胶中的基质成分定性和定量分析的实验研究；第二部分为人脐带脐带Wharton胶中MSCs的分离、培养及生物学性状的实验研究；第三部分人脐带Wharton胶中MSCs向软骨诱导培养的实验研究；第四部分为细胞因子在人脐带Wharton胶间质干细胞及其诱导产生的软骨细胞的表达.本研究从组织学、细胞学和组织化学、基因水平和蛋白表达水平探讨脐带Wharton胶及Wharton胶中MSCs的生物学特性和向软骨诱导的可行性。 方法：(1)???脐带组织进行组织化学和免疫组织化学染色，同时对Wharon胶进行葡萄糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)和总胶原含量的测定。(2)从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织，去除脐血管和外膜组织，剥离Wharton胶，采用胶原酶消化法和小组织块两种培养方法进行原代培养；对不同代的脐带MSCs进行生长曲线、表面标志、流式细胞检测表面标志、成纤维细胞集落生成单位(Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)、生长周期、冻存与复苏及逆转录PCR(Reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR)分析，并进行番红“O”染色、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨特异性标志的鉴定。(3)在DMEM中加入10％FBS，10ng/mLTGF-β1，25ng/mL bFGF，10-7M地塞米松作为诱导培养基。采用普通诱导培养、密集诱导培养、结合生物反应器技术体外构建无支架软骨组织。成软骨细胞表型通过番红“O”染色、甲苯胺兰染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴别。GAGs定量检测应用二甲基亚甲兰法，Ⅱ型胶原定量检测通过ELISA法。(4)分别对人脐带Wharton胶MSCs、向软骨诱导培养后的MSCs以及人软骨细胞进行细胞因子抗体芯片检测，比较人脐带Wharton胶MSCs软骨诱导前后与正常人软骨细胞细胞因子表达水平，为同种异体移植奠定实验基础. 结果：(1)人脐带组织富含胶原和GAGs，HE染色发现Wharton胶中含有大量的间质细胞；(2)采用酶消化法分离可以快速分离Wharton胶中间质细胞，并迅速贴壁生长；采用组织块法培养原代培养时间较长。流式细胞检测表明这些细胞表达CD44、CD105、CD271等MSCs标志物；不表达CD34、CD45等造血等标志物；HLA-ABC阳性表达，HLA-DPDQDR阴性表达。经过冻存复苏后免疫表型无显著变化。(3)未进行软骨诱导的细胞弱表达软骨细胞标志，诱导后GAGs和Ⅱ型胶原定量检测结果均显著高于未诱导细胞。RT-PCR结果显示人脐带Wharton胶MSCs诱导前后均表达SOX-9、Col-2al.人脐带Wharton胶MSCs经密集诱导培养后迅速结成膜状；采用密集诱导培养结合生物反应器培