酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒构建与鉴定.doc

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒构建与鉴定 　　摘要：采用PCR扩增酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ号染色体ARS304序列（S1）及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列（S2），并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中，获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1，说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。 　　关键词：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；自主复制序列（ARS）；重组质粒；复制起始活性 　　中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）21-4891-03 　　Construction and Identification of Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisiae ARS304 and Its Flank Sequence 　　LI Jun，WANG Xin，ZHANG Qi-sheng，CAI Lu 　　（Institute of Bioengineering and Technology，Inner Monglia University of Science and Technology， Baotou 014010， Inner Monglia，China） 　　Abstract： ARS304 gene（S1） and its flank sequence（S2） of Saccharomyces cerevisiae were cloned by PCR， and then connected into the shuttle vector pRS405. Recombinant plasmids pRS1 and pRS2 were successfully constructed and used for electroporation of S. cerevisiae. Results showed that the electricity transformation rate of pRS2 was higher than that of pRS1， indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304 in S. cerevisiae. 　　Key words： Saccharomyces cerevisiae； autonomously replicating sequence（ARS）； recombinant plasmids； replication origins activity 　　复制起始的调控涉及细胞周期的调控、基因扩增、肿瘤发生等重大生物学问题，是真核生物基因表达调控的重要内容。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中复制起始依赖的顺式作用元件被称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence， ARS），典型的ARS有一段11 bp富含A/T的保守序列[5’-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3’]，称为ACS（ARS consensus sequence），这些位点发生突变时会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能。在酿酒酵母Ⅲ号染色体上已发现有19个ARS元件，但却存在超过3 800个与ACS相似的序列，并且其中60%的序列能与ACS的8～10个位点匹配[1]，说明自主复制并不单纯受ACS元件数目、方向以及解旋基序数目所控制，其活性可能还与其他因素有关，诸如ARS侧翼序列特征、核小体定位、染色质修饰等[2]。对酵母的ARS进行研究，了解酵母染色体复制起始机制，有利于进一步在表观遗传学水平上探究真核生物复制机理。本实验构建并鉴定酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒，以期为以酵母为模式生物研究真核基因复制机制提供参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株和质粒 Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499（MATa ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭质粒pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Carol S. Newlon教授提供。 　　1.1.2 酶与试剂 DNA Marker、限制性内切酶、T4 DNA连接酶