杨浦五角场新王牌补习班土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.docx

第3课时　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数[目标导读]　1.了解尿素的作用原理及能被细菌分解的原因。2.理解并掌握筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法。3.掌握土壤微生物的取样、稀释、培养和观察。4.掌握尿素分解菌的鉴定方法。[重难点击]　1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。一　筛选微生物的研究思路要把某种微生物和其他的微生物分开，就要利用其代谢特点设计合适的培养基。1.筛选菌株(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的DNA聚合酶。1966年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌Taq，从该细菌中分离得到了耐高温的TaqDNA聚合酶。(2)原因：因为热泉温度70～80 ℃淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌被筛选出来。(3)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(4)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。(5)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(6)下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO4·7H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL①从物理性质看此培养基属于固体培养基，是由于加入了凝固剂琼脂。②从功能上看属于选择培养基，此培养基的氮源只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于选择培养基。2.统计菌落数目常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。(1)统计菌落数目①稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。②计数：一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。③统计：通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(2)活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数＝ (某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积)×稀释倍数。(3)统计菌落数目：关键是恰当的稀释度。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。小贴士　显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。?1?原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个?或16个?中格，每个中格进一步划分成16个?或25个?小格，计数室由400个小格组成。?2?操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。?3?计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。?4?缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。3.设置对照(1)教材中两位同学的统计结果中，第二位同学的结果接近真实值。实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。(2)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素；②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。(3)教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？答案　方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照