人类子宫内膜癌与mtDNA基因单倍群相关性研究.docVIP

人类子宫内膜癌与mtDNA基因单倍群相关性研究 　　[摘要] 目的 探讨mtDNA单倍群与子宫内膜癌的相关性。 方法 选取2010年1月～2012年10月间于我院就诊的子宫内膜癌患者32例作为观察组，另外选取同期在我院进行健康体检与其匹配的本地女性居民32名作为对照组。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法确定mtDNA单倍群，通过聚合酶链式反应-高温连接酶检测反应（PCR- LDR）的方法检测基因型与子宫内膜癌的相关性。 结果 观察组中有16例39个基因位点发生突变，其中mtDNA基因多态性改变有5例，对照组则有4例13个基因位点发生突变，mtDNA基因多态性改变有1例。两组比较差异有统计学意义（P 　　[关键词] mtDNA；子宫内膜癌；D-loop 　　[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）10-0011-03 　　线粒体基因组也叫线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质，是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形态。mtDNA结构简单，缺乏组蛋白和非组蛋白保护，环境特殊，处在活性氧及其他自由基包围之中，还缺乏有效的损伤修复系统[1]。因此，mtDNA易受各类诱变因素作用而发生损伤和异常，进而可能导致包括人类肿瘤在内的各种疾病的发生。目前研究发现，在人类多种实体瘤，包括头颈、乳腺、肺、胃、结肠、膀胱、前列腺和卵巢等处的恶性肿瘤细胞中均发现mtDNA突变或表达异常。单倍群（haplogroup）是指在分子进化过程中出现的一组类似的单体型，它们拥有一个共同的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的起源[2]。然而现在关于mtDNA与子宫内膜癌相关性尚未得到充分的研究。本研究对子宫内膜癌患者和健康女性血液中mtDNA中D-loop区基因多态和单倍群类型与子宫内膜癌之间的相关性进行研究，现报道如下。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象 　　选取2010年1月～2012年10月间于我院就诊的子宫内膜癌患者32例作为观察组，具体纳入标准如下：①经问卷调查证实为汉族，且三代之间没有血缘关系的舟山地区常住人口；②经病理切片确诊为子宫内膜癌，并且严格按照FIGO制定的手术-病理分期进行病理分期；③排除多囊卵巢综合征患者；④排除??期从事放射线暴露职业者及妊娠期和哺乳期妇女。根据FIGO临床分期[3]分为：Ⅰ期16例，Ⅱ期9例，Ⅲ期4例，Ⅳ期3例。组织学分级1级20例，2级7例，3级5例。对照组按照1∶1频数匹配的方法，即与病例在年龄（±5岁）、居住地等因素上匹配，选取同期在我院进行健康体检的本地女性居民约32名作为对照组，排除曾有子宫内膜癌病史及其癌前病变的对照。 　　1.2 研究方法 　　1.2.1 人口学及临床资料 本研究采用的调查问卷是统一编制、并经预调查评价及修订后使用，由经过培训的临床医师直接询问调查对象本人后填写。问卷调查的内容主要包括研究对象的一般状况（性别、年龄、婚姻、职业、文化水平等）、生活方式及习惯（如吸烟史、饮酒史、饮水史、饮茶史）、个人疾病史、肿瘤家族史、月经生育史等。并收集所有在临床体检和血尿常规中的信息资料，包括血压、血糖、肿瘤分期等。 　　1.2.2仪器与试剂 仪器：PCR扩增仪、自动核酸测序仪、冷冻高速离心机、凝胶成像系统、电泳仪及电泳槽、生物分光光度计、-86℃深低温冰箱、恒温水浴箱、电子天平、移液器等。试剂：溶血试剂、核悬浮液、蛋白酶K、氯仿、冰冷无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、TE、异丙醇等用于mtDNA抽提。Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs溶液、DMSO溶液等用于核酸扩增。各种限制性内切酶、琼脂糖、0.5×TBE溶液、溴化乙锭（EB）等用于凝胶电泳。 　　1.2.3血样采集及DNA抽提 确认研究对象知情同意后，现场采集其外周静脉血约 5 mL，随后置于-80℃冰箱低温冻存。采用酚氯仿法抽提白细胞mtDNA，即将血液经蛋白酶K消化后加入饱和酚并振荡离心，收集上清液加入氯仿-异戊醇振荡离心，再收集上清液加入冰冻无水乙醇，洗涤后收集沉淀烘干备用。对抽提产物进行核酸定量，并加相应TE溶液稀释到约50 ng/μL，置于-80℃冰箱保存备用。 　　1.3多态基因型检测 　　采用Sanger直接测序法、聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）和聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）等多种分子生物学技术进行基因分型[4]。9 bp del位点PCR产物直接使用质量分数为3%的Nussive凝胶电泳检测，其余应用D