土壤生态学实验指导.docVIP

土壤生态学 曹志平 胡菊编 2007年10月24日实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量--------------------1 实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定--------------------4 实验三、土壤螨类的分离------------------------------------6 实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量 目前国际上通常采用的有直接计数法和间接计数法两种。直接计数法（direct counting method），顾名思义，就是对土壤中的原生动物不进行培养，而是取一定量的新鲜土壤，加一定量的水或土壤浸出液，摇匀后即进行镜检，得到土壤原生动物丰度（单位重量土壤中的原生动物个数）。间接记数法主要是培养记数法。鉴于土壤这一特定环境，土壤原生动物种类都能形成胞囊，以渡过土壤干旱环境。风干后土壤原生动物形成的胞囊，用培养的方法诱导脱开胞囊，以推知其种类和数量分布。在培养过程中一切器皿、培养基均经高压灭菌，接种时也应避免尘埃落入，以确保培养不受污染。本实验主要采用Singh（1995）和Stout（1962）的“3级10倍”环式稀释法。 仪器、设备和材料 烘箱、培养箱、灭菌锅、培养箱、镊子、玻璃环、三角瓶、烧杯等。 方法与步骤 1土样采集 土壤原生动物很难直接从土壤、水体中采集，要通过室内培养。土壤原生动物在土壤环境干旱时，都能形成胞囊，以等待土壤水分来临后再脱胞囊而活动。所以土壤原生动物的采集，实际上是采集土壤样品，带回实验室进行培养而取得标本。 由于原生动物在土壤中的分布是不均匀的，因此在一个采样区内，需采集10个采样点。用圆形采样器取土样，把土样放入铝盒带回室内。在培养之前，需测定土样含水量。 2 稀释土样 2克风干土样（如有条件，也可以直接用湿土）加18毫升无菌水，充分振荡，可用超声波仪粉碎土壤，使之与水充分混合，这时的稀释度为10；然后用定量吸管吸取2毫升102的土壤悬浮液，加入18毫升无菌水，充分摇匀，此时稀释度为103。依此法逐级稀释，即可得到103、104、105、106……的稀释液。根据原生动物的丰富度选择土壤的稀释度，但每一定量土样均要选择连续的3个稀释度，，即“3级10倍”之意（图1）。 3培养基制备 0.5克氯化钠加1.2克琼脂加98毫升蒸馏水（如用量较多，可按此比例增加），搅拌后在高压灭菌锅中加热灭菌，然后趁热到入培养皿，在凝固之前插入5个内径为1.8厘米、高为0.6厘米的玻璃环。每个土样需6个培养皿30个玻璃环。 4接种、培养和镜检 取其中的连续3级悬浮液，摇匀后每级稀释液各取1ml接种于各自的玻璃杯内，即1、2号培养皿的10个玻璃杯内各滴入1ml第一级稀释液，同样3、4号和5、6号培养皿的10个玻璃杯内分别滴入第二级和第三级稀释液（第一、二、三级稀释液的稀释度是多少，则取决于研究的土壤中原生动物数目的多寡，如采用104-106稀释度系列，则第一级稀释液为104，第二级为105，第三级为106），置于光照培养箱25℃以下培养(图1)。分别在第4、7、11天时在低倍镜下观察每个环中有无原生动物，按肉足虫、鞭毛虫、纤毛虫分别记录。低倍镜下可分清此三大类，但无法鉴定种类。可在实验结束时，再吸出在高倍镜或油镜下鉴定种类。 图1 土壤原生动物定量培养法的稀释和接种示意图 5 结果统计 根据未出现环数，查Stout“3级10倍稀释法”（表1）原生动物密度换算表得知每克土壤中的原生动物数量，即密度。例如，已知鞭毛虫在30个环中有5环中未出现，则查表得λ=69.5，若稀释度为104-106，则鞭毛虫的密度为695000个/克土壤。肉足虫和纤毛虫的密度也同此法求得，三大类密度之和即为总的原生动物密度。这是根据微生物数量统计法的原理从没有原生动物和土壤稀释度求出最或然数（MPN），以此推断每克风干土壤中原生动物数量。将表上查得的数量乘以土壤湿度，即为每克湿土中原生动物数量。 表1 “3级10倍”环式稀释法原生动物密度换算表（Stout，1962） 无原生动 物的环数 λ 土壤中原生动物的个数/g 10-103 102-104 103-105 1 230.3 2303 23030 230300 2 160.9 1609 16090 160900 3 120.4 1204 12040 120400 4 91.6 916 9160 91600 5 69.5 695 6950 69500 6 52.0 520 5200 52000 7 38.7 387 3870 38700 8 29.2 292 2920 29200 9 22.7 227 2270 22700 10 18.0 180 1800 18000