生化试验课件实验八：质粒提取琼脂糖凝胶电泳检测.pptVIP

* 实验八 质粒提取与电泳 Extraction and Identification of Recombinant Plasmid 刘向华 南京医科大学 生化与分子生物学系 Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology 实 验 目 的 1、学习碱裂解法提取质粒的原理 2、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法 3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作 实 验 原 理 质粒(Plasmid) 　　是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA。 质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。 在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 DNA琼脂糖凝胶电泳： 电荷效应与分子筛效应 核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快 质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。 pH调至中性，变性的质粒DNA恢复到原来的构型， 而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。 碱变性条件下, 染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开, 双链不会完全分离。 实 验 步 骤 取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。 P1：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性； 增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。 EDTA：螯合核酸酶 加250μl溶液P2，温和地上下翻转10次使菌体充分裂解至清亮。 P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。 NaOH使DNA变性，SDS使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。 加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。 P3：醋酸/醋酸钾溶液，使溶液pH值恢复接近中性。此时质粒DNA复性，而染色体DNA难以复性。SDS遇到K+变成十二烷基硫酸钾，不溶于水， 连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。 加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃滤液。 加500μl漂洗液WB，13000rpm离心60sec，弃滤液。 （重复一遍） 取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl 洗脱缓冲液EB，放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA， -20℃保存。 空柱13000rpm离心2min。敞口放置3min，除去残留乙醇。 将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。 注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上， 加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。 P4：缓冲液，湿润、平衡吸附膜 加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解，至溶液变清亮。 取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。 加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6~10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。 吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。 加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。 加500μl漂洗液WB，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。（重复一次） 取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中加热效果更好），放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存。 空柱13000rpm离心2min。放置3~5min，除去残留乙醇。 将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。 琼脂糖凝胶电泳 样品：10 μl质粒样品 + 2 μl上样缓冲液，混匀 电泳：90~120mA，电泳20~40分钟 配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于TBE缓冲液中， 配成1%~1.2%的琼脂糖凝胶 上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp Marker P EP － ＋ 实 验 结 果 负极 正极