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蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法 　　中华人民共和国国家标准　 　　蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法GB12392-90 　　Methodfordeterminationoftotalascorbicacidinfruits,vegetablesandderivedproducts-Fluorometricmethodandcolorimetricmethod 　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了用荧光法和2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸。 　　本标准适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。 　　第一篇　荧　光　法 　　　本标准参照采用国际标准ISO6557/1-1986《蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸的测定方法》。 　　2　原理 　　　样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 　　脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质产生的干扰,最小检出限μg/mL。 　　3试剂 　　本实验用水均为蒸馏水。 　　　偏磷酸-乙酸液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水,加温,搅拌,使之逐渐溶解,冷却后加水至500mL。于4冰箱可保存7～l0d。 　　　/L硫酸:取10mL硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200mL。 　　偏磷酸-乙酸-硫酸液:以/L硫酸液为稀释液,其余同配制。 　　50％乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠(CH3COONa·3H2O),加水至1OOOmL。 　　硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,溶于l00mL乙酸钠溶液()中。临用前配制。 　　　邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100mL。 　　抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)(临用前配制)：准确称取50mg抗坏血酸,用溶液()溶于50mL容量瓶中,并稀释至刻度。 　　抗坏血酸标准使用液(l00μg/mL)：取10mL抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。定容前试pH值,如其pH时,则应用溶液()稀释。 　　%百里酚蓝指示剂溶液:称取百里酚蓝,加/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为mL,磨溶后用水稀释至250mL。 　　变色范围：pH值等于　　　红色 　　　pH值等于　　　黄色 　　　pH值大于4　　蓝色 　　活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9盐酸中,加热回流1～2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110～120烘箱中干燥,备用。 　　4　仪器和设备 　　　实验室常用设备。 　　　荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。 　　　捣碎机。 　　5　操作方法 　　　样品液的制备：称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液(),倒入捣碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或蓝色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40～100μg/mL之间,一般取ZOg匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL,过滤,滤液备用。 　　　测定步骤 　　　氧化处理：分别取样品滤液()及标准使用液()各100mL于200mL带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。 　　　各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中,分别标明”样准”及”样准空白”。 　　　各取10mL样品氧化液于2个100mL容量瓶中,分别标明”样品”及”样品空白”。 　　　于”标准空白”及”样品空白”溶液中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至100mL,在4冰箱中放置2～3h,取出备用。 　　　于”样品”及”标准”溶液中各加入5mL50%乙酸钠液,用水稀释至100mL,备用。 　　　标准曲线的制备 　　　取上述”标准”溶液()(抗坏血酸含量10μg/mL)、、和标准系列,取双份分别置于10mL带盖试管中,再用水补充至。荧光反应按。 　　　荧光反应 　　取()中”标准空白”溶液,”样品空白”溶液及()中”样品”溶液各2mL,分别置于10mL带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35min,于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用。 　　6　计算 　　c·V　　　100 　　X=×F×━━━━