第九节 高压液相色谱.pptVIP

第九章 高压液相色谱 高压液相色谱 （High Performance Liquid Chromatograph 简称HPLC）又称高速或高效液相色谱 1）吸收了普通液相层析和气相色谱的优点； 2）它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性的物质），又有气相色谱的特点（即高压、高速、高分辨率和高灵敏度）； 3）适用于很多不易挥发，难热分解物质（如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析及其制备和分离。 优点： 现代高效液相色谱法的特点： 1）高压：工作压力高达20MPa~30MPa 2）高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟 3）高效：塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高 4）高灵敏度：UV检测器的检测限达10-9g，荧光检测器的灵敏度可达10-11g 快速蛋白液相色谱（Fast Protein Liquid Chromatograph FPLC） 能在惰性条件下，以极快的速度把复杂的混合物通过成百上千次层析分开。如果连续进样，一天内可制出大量的欲纯化物质。 按其固定相的性质可分： 高效凝胶色谱 疏水性高效液相色谱 反相高效液相色谱 高效离子交换液相色谱 高效亲和液相色谱 高效聚焦液相色谱原理与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同：高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 LC-MS液质联用仪 液质联用技术现已发展成为最重要的定性、定量分析方法之一，在生物、医药、化工、农业和环境等领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢化学的研究工作中，液质已经成为最重要的研究方法之一。 高效液相色谱仪主要有： 进样系统 输液系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 高效液相色谱 溶剂输送系统（高压泵） 进样系统（进样阀） 分离系统（色谱柱） 检测系统（检测系统） 1. 进样系统 采用隔膜注射进样器高压进样阀进样进样量恒定，有助于提高分析样品的重复性 2. 输液系统 高压泵、流动相贮存器和梯度仪 高压泵的压强为1.47-4.4×107 Pa 优点：流速可调且稳定，高压流动相通过柱层析，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，可提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性。 高效液相色谱的流动相要求： 1）应具有足够的纯度，选用色谱纯试剂 2）流动相与固定液应互不相溶 3）流动相对试样各组分应有适当的溶解度 4）粘度小 5）检测器对流动相不产生响应 流动相贮存器和梯度仪，可改变洗脱液的极性、离子强度、pH值、或改用竞争性抑制剂或变性剂等。使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 采用梯度洗脱，可以提高分离效果 梯度洗提脱：在分离的过程中，应用梯度洗提装置，按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，从而改变样品中不同极性的组分的相对保留值，提高分离效果，加快分析速度。 3. 分离系统 包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱长度为10-50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管）。内径为2-5mm。由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5-10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。 固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成。特点： 惰性（如硅胶表面的硅醇基团基本已除去） 多孔性（孔径可达1000Å） 比表面积大 其表面经过机械涂渍或用化学法偶联各种基团（如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物，对结构不同的物质有良好的选择性。  基质粒度小，能提高分辨率： 固定相基质粒度小，柱床易达到均匀、致密状态，易降低涡流扩散效应，微孔浅，样品在微孔区内传质短，能缩小谱带宽度、提高分辨率。 根据柱效理论（即塔板理论数N与理论塔板高度H成反比，而H与颗粒度的平方成正比）分析，基质粒度越小，塔板理论数N就越大，分辨率也越高。另外，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃，改善传质速度、缩短分析时间，增加层析柱的效率。  色谱柱 常用内壁抛光过的不锈钢制成 标准柱型：内径为4.6mm 或 3.9mm，长为15cm-30cm 的直形不锈钢柱 填充柱的方法：干法和湿法 颗粒直径大于20μm的可用干法填充 颗粒直径10μm以下的采用湿法装柱 湿法装柱每米柱效可达3万塔板 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成 柱的使用和维护注意事项：色谱柱的正确使用和维护十分重要，否则会降低柱效、缩短寿命甚至损坏。 需要维护色谱柱： ① 避免压力和