质粒DNA的提取、定量、切与PCR鉴定.docVIP

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280=1.8 DNA纯净 A260/A2801.8 表示蛋白（芳香族）或酚类物质材料与方法一实验材料2×Premix Taq、引物ＤＮＡDNA、10×MBuf R、EcoR I(12U/ul)、Hind III (15U/ul) Gelview、TBE、DNA Marker 5000电泳缓冲液 2. 质粒DNA的提取与制备 3. 质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 4.质粒DNA的酶切鉴定 5.琼脂糖凝胶电泳 四、结果与讨论 （四）实验分析 1.实验数据分析： 由上数据可知，Ratio=1.82 A260/A280＞1.8 含RNA杂质，应用RNA酶去除，但就该数值而言，它与1.8较为接近，即表示RNA杂质并不多。 2.电泳图谱分析： A谱带中：质粒DNA中出现的三条带分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。三种状态DNA分子迁移率相异，速率最慢者为开环状分子，中者为线性分子，最快者为超螺旋DNA分子，故上述谱带自下而上依次是：超螺旋型DNA、线性DNA和开环DNA。 对比A、B、C谱分析，酶切反应质粒DNA后应含两种DNA片段，如图，在C谱中2000-3000bp和250-500之间分别有两条不同的显带，上带与B谱水平，应为酶切长片段，下带则为含插入DNA片段的酶切短片段。而预期酶切长片段大小在2000bp-3500bp，短片段分子大小在250-500bp之间。本结果符合预期。 3.实验中需注意的事项： 微量加样枪的使用：在使用同支加样枪取不同液体时应更换枪头。取液时按压在第一停点并释放按钮，释液时按压第二停点才释放按钮。 在质粒DNA提取的实验加入溶液S2一步，应短时、轻慢，缓和颠倒。 在电泳实验中，点样时防止气泡产生，且应防止移液枪回吸点样液，即当枪头离开液面方释放按钮。 思考题： （1）碱裂解法提取质粒时，溶液I、II、III的作用分别为？ 溶液I用于金属离子螯合以抑制脱氧核酸酶降解DNA；有利于溶酶体作用。 溶液II：使细胞壁肽聚糖在碱性下水解，并让核酸和蛋白变性。 溶液III：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。 （2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ ①选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。 ②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul，且酶切反应中甘油浓度应低于5%。 ③底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。 ④反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适离子强度可以激发酶切反应。 准备目的DNA：煮沸菌液10分钟，冷冻，室温解冻后离心，取上清液 取0.2?ml?PCR反应管一只，用微量加样枪下述顺