叶绿色素的提取分离、理化性质-清华.docVIP

现代生物学导论 普生实验报告 叶绿色素的提取分离、理化性质和含量测定 生医9 田雪霏 2009013189（同组人：蒋楠） PART A 实验名称：叶绿色素的提取与分离 实验原理 叶绿体中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。 实验材料与试剂 新鲜的菠菜叶片 体积分数为95% 的乙醇，CaCO3粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，体积比） 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。 实验步骤 （一）、色素提取液的制备 1．取新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中 2．研钵中加入少量CaCO3，加2～3ml体积分数为95% 的乙醇，研磨至糊状，再加15ml 体积分数为95% 的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml 体积分数为95% 的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其它相关实验。 （制备的叶片中叶绿体色素的提取液） （二）、叶绿体色素的分离 1. 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm 处用毛细管划线，风干或吹风机吹干后再划第二次，重复操作3～4次。 2. 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放入，使其下端浸入展开剂中。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的色带。 当各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。 —————————— 展开剂前沿，7cm —————————— 胡萝卜素， 6.5cm —————————— 叶绿素a ， 5cm —————————— 叶绿素b ， 4.6cm —————————— 叶黄素， 4.2cm —————————— 点样区， 0cm 实验结果与分析 叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。各色素带的位置可用相对比移值Rf来表示。即Rf=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至原点的距离。 由于不同分组有不同的Rf值，所以比较其值可以进行定性分析。但影响其值的因素也有很多。如展开剂的极性、组成和配比，吸附剂的种类、颗粒度，层析缸的形状和大小、温度等。因此引用标样作对照实验进行定性分析更加可靠。 提取液 溶剂样品的溶剂应避免用水，因为水溶液点样时容易扩散。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等易挥发的有机溶剂。点样溶剂应能迅速挥发，并减少空气中水蒸气对薄层吸附剂的影响。 硅胶 硅胶主要成分为无定形二氧化硅，化学性质稳定，具有微孔结构，有很强吸附能力，为常用的吸附剂。其表面有很多硅醇基团，—OH 与色素分子形成氢键结合而产生吸附作用，色素的极性越大，被硅胶吸附得越牢。 展开剂 由几种溶剂混合的展开剂，占比例较大的主要溶剂在展开剂中起溶解物质和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整改善分离物质Rf值及对某些物质的选择作用。混合展开剂中各溶剂极性顺序为石油醚苯丙酮，根据比例，此展开剂为弱极性 色素 叶绿体色素的极性决定于其分子中所带官能团的极性，依据饱和烃、不饱和烃、醚、酯、醛、酮羟基化合物、酸和碱的极性依次增强分析各色素结构得出：胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强 色素展开顺序 根据展开剂、硅胶和色素的性质，各种色素由下至上的展开顺序为：叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、胡萝卜素。由于薄层色谱的灵敏度较高，色素当中的同分异构体有时也会显出色素带，因此色素带不只限于以上四种。 PART B 实验名称：叶绿体色素的理化性质 实验原理： 叶绿素可与碱起皂化反应生成甲醇及和叶绿醇及叶绿素盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的Mg可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在强光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 实验材料与试剂 新鲜菠菜叶片 刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10m