义：pcr技术及其应用周俊宜.pptxVIP

目 录PCR技术简史 PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用DNA解旋解链5’3’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋酶解链酶合成引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’子链延长DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史DNA解旋解链GGAUCG5’3’5‘ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCRNA引物合成引物RNA引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’5‘AUCGCG子链延长DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史引物酶引物酶DNA解旋解链TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG5’3’3’5‘ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC合成引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’5‘3’AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG子链延长DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史DNA聚合酶DNA聚合酶1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史Kary B. Mullis The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物Sanger的测序技术M13噬菌体DNA聚合酶引物引物特定DNA片段DNA聚合酶引物Mullis的构思引物DNA聚合酶94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taqfile:///D:\日常教学\dmt\PCR-附件-1.ppt DNA聚合酶（thermus aquaticus)100 80 60 40 20酶活性(%)40 50 60 70 80 90 100温度(℃)94℃55℃72℃PCR循环标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点123高温变性低温退火适温延伸94温度（℃）72552212345时间（min）PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理重复1~3步25~30轮DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性DNA双螺旋95℃123高温变性低温退火适温延伸重复1~3步25~30轮94温度DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上（℃）72子链延伸DNA加倍55DNA单链与引物复性22DNA双螺旋12345时间（min）PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理模板DNA95℃DNA引物50℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理引物1引物2DNA引物50℃72℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理Taq酶引物1引物2Taq酶95℃72℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第1轮结束第2轮开始95℃50℃72℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理TaqTaqTaqTaq72℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第2轮结束模板DNAPCR的基本原理第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增PCR反应条件PCR过程PCR的特点第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达