第四章 基因的表格达.ppt

载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点： 5、几种类型的原核表达载体 1）. 非融合型表达载体 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列： 2）. 分泌型表达载体 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 分泌信号肽外膜蛋白基因 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 3）. 融合蛋白表达载体：如pGEX系列 ?优点： 便于融合蛋白的分离和纯化。 lacI tac lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA lacP GST：谷胱甘肽巯基转移酶 柱（column） GST 外源蛋白 凝血酶 外源蛋白 柱（column） GST GST 洗脱 柱（column） 可再利用 GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。 分离和纯化： 其它融合蛋白系统： His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。 5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’ ① -35box ② -10box（Pribnow Box） 6、影响外源基因表达效率的因素 1）. 启动子的结构对表达效率的影响 RNA聚合酶 σ亚基的识别位点 （1）一致顺序 （2）-35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 （3） -35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 5’-TTGACA TATAAT 一致顺序 lac trp ?PL recA tac I tac II 5’-TTTACA TATGTT 5’-TTGACA TTAACT 5’-TTGACA GATACT 5’-TTGATA TATAAT 5’-TTGACA TATAAT 5’-TTGACA TTTAAT -35box -10box S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）, 翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。 2）. 转译起始序列对表达效率的影响 （1）S-D序列 5’-AGGAGGU-3’ ？？？？ AUG左侧的三个碱基有影响。 （2）起始密码AUG 3）. 启动子与外源基因之间的距离 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。 4）. 转录终止区对表达效率的影响 5）.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 6）.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 1）、表达载体的优化设计； 2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性； 3）、密码子偏爱性； 4）、表达环境条件的优化。 7、提高外源基因表达常用的方法与途径 ?1）、表达质粒的优化设计 启动子：选择诱导型强启动子 如进行基因的诱导表达，将宿主生长代谢与外源基因表达分开。 SD序列：UAAGGAGG高于3倍AAGGA； 调整SD序列和起始密码AUG间碱基长度：一般为5-9bp 为宜； SD序列和起始密码AUG间碱基序列：A/T丰富则翻译效率高。 ?2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性： 目标基因mRNA的序列和结构改造：5`加“发夹”结构；3`加稳定序列； 采用缺乏某种蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌； 改造基因碱基序列 包涵体形式、融合型表达目的基因。 ?3）、密码子偏爱性： 基因突变改变稀有密码子 共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因 4）、表达环境条件的优化。 培养基 温度 8、据蛋白用途选择基因的表达策略 1）、表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究 ——主要考虑保持蛋白质原有的功能不变 表达策略： ?融合表达 ?直接表达 2）、表达蛋白用作抗原 ——主要考虑表达蛋白的快速提纯 表达策略： ?以包涵体形式合成目的蛋白 ?融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白） 3）、表达蛋白用作结构研究 ——表达蛋白以天然可溶形式产生 表达时考虑因素： ?表达温度（高温促进包涵体的形成） ?表达水平（高表达促成包涵体的形成）