江苏省203年栟茶中学高三生物考前赢分30天 第30天.docVIP

2013年江苏栟茶中学高三生物考前赢分30天 第30天 1、DNA的粗提取与鉴定 （1）．思路：利用DNA与RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 （2）．原理 利用DNA的溶解性 ①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl中溶解度不同，盐浓度为0.14mol/l时，DNA溶解度最小。 ②DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白质则溶于酒精。 利用DNA的耐受性 ①蛋白酶水解：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。 ②高温变性：大多数蛋白质不能忍受60℃—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 ③洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 （3）．实验设计 ①材料的选取：选用DNA相对较高的生物组织。 ②细胞的破碎（以鸡血为例） 鸡血细胞 用玻璃棒搅拌 收集滤液。 ③杂质的去除：方案之一是利用DNA在不同浓度的NaCl中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。 ④DNA的析出：处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、95%冷却的酒精溶液可使DNA析出。 *动物材料：加水-过滤-加NaCl-加水-过滤-加NaCl-过滤-加酒精-搅拌析出（轻缓，以免DNA分子断裂） *植物材料：碎——磨（加洗涤剂和食盐）——滤（纱布，滤去杂质）——析（加冷酒精） （4）．提纯方法 ①盐浓度为0.14mol/l，DNA析出 ②木瓜蛋白酶处理，去除蛋白质杂质 ③60-75℃保温10-15min ④95%的冷酒精：蛋白质溶解，DNA不溶 ⑤过滤、离心等 （5）．DNA的鉴定 DNA溶解在2 mol/l的NaCl溶液中 + 二苯胺试剂 溶液颜色变蓝。 对照组不加丝状物，其他与实验组相同 1、分离蛋白质的常用方法和原理 （1）凝胶色谱法 ①概念：凝胶色谱法也称作分配色谱法 ，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 ②原理：大多数凝胶是由多糖类化合物 构成的，如葡聚糖 或琼脂糖 。其内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长 ，移动速度较慢 ；而相对分子质量较大 的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短 ，移动速度较快 。相对分子质量 不同的蛋白质因此得以分离。 缓冲液 ①作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱 对溶液PH 的影响，维持PH值基本不变。 ②配置：通常由1—2 种缓冲剂溶解于水中配置而成。调节缓冲剂的使用比例 就可以制得不同PH范围内使用 的缓冲液。 （3）电泳 ①概念：带电粒子在电场 的作用下发生迁移 的过程。 ②原理：许多重要的生物大分子，如多肽 、核酸 等都具有带电的基团，在一定PH下，这些基团会带上 正电 或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极 移动。电泳利用了分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。 2、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 样品处理 血红蛋白由四个肽链组成，包括两个α-肽链和两个β-肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈红色。 红细胞的洗涤： （I）目的：去除杂蛋白 （II）方法：低速短时间 离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆 ，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯中，再加五倍体积 的生理盐水，缓慢搅拌10min ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次 ，直到上清液没有黄色 ，表明红细胞已洗涤干净。 血红蛋白的释放： 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水 到原血液的体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器 上充分搅拌10min。 分离血红蛋白的溶液：将搅拌好的混合8高速离心后，观察到试管中溶液分为四层 第1层：无色透明 的甲苯层 第2层：脂溶性物质 的沉淀层--白色 薄层固体 第3层：血红蛋白 的水溶液--红色 透明液体 第4层：其他杂质的暗红色 色沉淀物。 ④透析：取1ml的血红蛋白 溶液装入透析袋 中，将其放入盛有300ml的20mol/L的磷酸缓冲液 中（PH为 7 ） （去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品中的缓冲液） （2）凝胶色谱操作： （1）凝胶色谱柱的制作：（略看） （I）柱底部制作： a．选择合适的橡皮塞，中间打孔 b．在橡皮塞顶部切出锅底状的凹穴 ，在0. 5ml的移液管 头部切下5cm 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。 c．剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的凹穴 。用大小合适的100目 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管上部一