多肽抗原的设计与抗体制备ppt课件.ppt

多肽免疫注意事项 佐剂与抗原一定要充分混匀，以混匀后静置长时间不分层作为混匀充分的标准。 每种抗原大概1.5ml,一般皮下免疫四到五点，每点大约0.25m，每点间隔大概1-2cm.不能为了图省事，就直接免疫一到两点，这样抗原的吸收会不好。 每次免疫要新选择兔子背部上未免疫区域，因为免疫过的区域皮肤有时会结痂变硬。 免疫过程中尽量避免扎到血管，引起出血和感染。 兔子取血和血清保存 颈动脉取血，每只兔子大概能收集35ml左右的血清。分装2.5ml（0.5ml血清+0.5ml甘油）其余的血清冻于-28℃ ，禁止冻融。 血清一般不建议加叠氮钠，因为叠氮钠上的氨基基团会干扰偶联反应和许多标记反应。而且我们取血的器械，50ml离心管都是经过高压灭菌的。 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 肽封闭实验确定抗体的特异性 Western 实验中经常能见到一条或超过一条带，为了确定哪一条带是特异性的针对抗多肽的抗体。 例如：Fas:（335aa) SR0065 (42-55aa) TTVETQNLEGLHHD 戊二醛 交联 实验步骤 1：确定Western 实验所用抗体的效价和血清量 通常我们一条膜需要用 5ml blot buffer,按 1:50稀释血清,需要100ul 血清。 2：封闭所用的抗原肽一般为血清量的5到50倍。也就是说如果1ug的血清，需要5到50ug的多肽。 来源于兔血清总抗体浓度为10ug/ul,特异性抗体的浓度一般为总抗体的10%，也就是1ug/ul。100ul的血清需要封闭的肽量为1mg。 3：称取1mg肽溶于900ul PBS中，加入100ul血清，37℃翻转2小时，4 ℃翻转5小时。同时做一不加多肽的对照。 4：4 ℃，12000rpm,15mins.小心的吸取上清作为一抗加入到反应盒中 结果观察 阳性结果 Fas SR0065 阴性结果 TOP2A SR0065 抗体纯化 DEAE-纤维素 Protein A 多肽抗原柱亲和纯化 亲和纯化 NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH2-Tris NH2-Tris NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH2-Tris + 交联 封闭 结合 洗脱 Made by puyong 2006.6.4 多肽抗体的纯化结果 SIP1（HA）YPYDVPDYA 纯化前 19/10/05 2mins 纯化后 11/12/05 曝光过夜 纯化抗体考马斯亮蓝染色结果 甘氨酸洗脱（1)高值 甘氨酸洗脱（1)低值 三乙胺洗脱（1）高值 三乙胺洗脱（1）低值 protein marker BSA 4ug 甘氨酸洗脱(2)高值 甘氨酸洗脱(2)低值 三乙胺洗脱（2）高值 三乙胺洗脱（2）低值 甘氨酸洗脱（3)高值 甘氨酸洗脱（3)低值 三乙胺洗脱（3）低值 三乙胺洗脱（1）高值 注：每种洗脱的抗体均上样10ul SR0002 Drosha GAAMDALEKYNFPQ 纯化前1 9/10/05 2mins 将SROOO2甘洗脱(1)高值5.5ml，甘洗脱(2)高值3.2ml,甘洗脱(2)低值8ml，甘洗脱(3)高值2.7ml,甘洗脱(3)低值2.7ml,三乙胺洗脱（3）高值3.3ml收集在一起共25ml，加入NaN3至终浓度0.05%，BSA至终浓度0.5%。混合后的抗体再次进行Western 检测，结果见下图： 未纯化血清 混合后的抗体1:100 混合后的抗体1:50 混合后的抗体1:25 混合后的抗体1:250 16/12/05 30mins 16/12/05 30mins 纯化抗体考马斯亮蓝染色结果 2ugBSA 4ugBSA Protein marker 甘氨酸洗脱（1)高值 甘氨酸洗脱（1)低值 甘氨酸洗脱（2)高值 甘氨酸洗脱（2)低值 甘氨酸洗脱（3)高值 甘氨酸洗脱（3)低值 三乙胺洗脱（3）高值 三乙胺洗脱（3）低值 8/12/05 注：每种洗脱的抗体均上样10ul 将不同次纯化的抗体混合后考马斯亮蓝染