认识裂峰.docVIP

认识裂峰(上） （本篇由中国色谱网的ttx和恐龙共同翻译） 认识裂峰 （Cory Hawkins, John W.Dolan） 液相分离中，峰分裂有几种可能。这个月的“液相疑难解答”谈谈峰分裂的几个可能原因并提供一些确定峰分裂原因的方法。因为峰分裂有可能是不正确的色谱方法引起，所以仔细地分析问题的来源是很重要的。如果真是可能的话，你可以改变色谱方法来避免或延迟问题的出现，总之，你的方法将会更可靠。一个峰还是两个峰？通常分析者发现峰分裂的时候，总是首先问到这样的问题：“这是一个变形的峰还是实际上含有两个没有分开化合物的峰？”上月“液相疑难解答”（1）讨论问题的时候我们遇到了这个情况。图1显示了一个我们关注的色谱图的局部。图1a主峰上的一个肩峰，减少进样量后变成了图1b的第二个峰。改变进样量是帮助详细描述色谱图特点的一个简单方法。如果肩峰是单峰的变形，它很可能与进样量成比例的变化而不是象图1那样变成两个峰。改变进样量后，我们可以按逻辑有步骤地改变色谱条件，找到可以让两个不同物质有合适分离度的条件。有多少峰受影响？上面的例子里，那个色谱图包含在一个液相串联质谱（LC-MS-MS）测定中，可以推定为单一物质的峰。但是对于多数方法，色谱图中有多个峰。这些峰或者是LC色谱法在LC-UV分离出来的多个样品组分或者是在LC-MS-MS中的一个样品峰和一个内标峰。无论哪一种情况，色谱工作者都知道有不止一个峰存在，他们就可以通过对色谱图中所有峰的观察来获得与问题实质相关的更多信息。图1：存在第二种成分造成的裂峰。药物（第二个峰）在血浆中浓度分别为（a）25 ng/mL （b）10 ng/mL。图2 峰变形—（a）脱尾 和（b）分裂—色谱图所有峰都受到相似的影响。详见正文图2显示了这种情况，当色谱图中所有峰都出现相同的变形—或是图2a的严重拖尾，或是图2b的峰分裂，这表明与样品峰有关的问题在分离之前就发生了。通常，像这样整个色谱图中峰都变形的原因最可能是滤片阻塞或者是柱头塌陷。图3显示了滤片阻塞如何改变峰形的一种可能解释。在这些图中，圆柱划线部分表示柱头的滤片。当滤片正常工作的时候（图3a），流动相就顺利地以基本平行的路径流过去。样品在这样的情况下进入柱子就能均匀分布地通过柱子前端并正常地流出柱子。但如图3b所示，滤片被泵密封圈掉下来的或者没有过滤好的样品中的一小片微粒物部分堵塞了。堵塞会干扰柱头的流体曲线，造成注射进去的分子在另一部分样品之后到达柱子。这变形的流体曲线在色谱分离之前就发生了，所以变形会出现在后来通过柱子的每一个样品组分，结果每一个峰都有相似的外貌（见图2）。另外一个在柱头上引起峰变形的原因是填料塌陷。在某些情况下，塌陷显得像沉积的柱床；另外一些情况下则像填料中的蛀洞。后一种情况中，一些分子会像冲过通道一样比其他的分子更快地流过柱子的前端。同样的，变形发生在色谱分离之前，所以它以相似方式影响了每一个峰。图3：示意图表示样品进入柱子入口时（a）处于正常情况下（b）滤片部分堵塞认识裂峰(下） 改正问题色谱工作者有两个标准的办法来修复堵塞的滤片。一是反冲柱子，二是更换滤片；两种方法都有三分之一的几率可以解决问题。工作者可以放心，反冲柱子会把滤片的污染物冲走而且使柱子有正常的功能。尽管柱子上有一个箭头表示流动相流动方向，但差不多所有的硅胶基质的柱子都可以按任意方向使用而不会被损坏。（如果你不能确定请向生产商查实）你只要简单地把柱子拆下来并反过来接。新的出口先不要接上连检测器的管子，用20到30mL流动相冲柱子，冲走松动的微粒物。让柱子保持反接来使用也是可以的。过去，换滤片是常规的操作，但是我们不知道现在还有那个实验室还会定期更换滤片。人们不再更换滤片有几个原因。第一，所有的柱子以前都有备用滤片，但是现在没有了，所以不容易获得所需要的滤片。第二，现在的填装技术让柱子中的填料受到一定的压力，取出滤片的时候，填料会从柱子中流出，从而不可逆地破坏了柱子。第三，在线前置过滤器的广泛使用，现在已经很少像以前不用过滤器的时候那样遇到滤片堵塞的情况了。作为使用的指南，如果反向使用柱子不能改正峰变形的问题，明智的做法就是丢弃这根柱子换一根新柱。对于现在的柱子，填补塌陷的柱子不实际也没有效果。如果柱子塌陷经常发生，那么就使用保护柱，换用腐蚀性较小的流动相，使用化学性质更稳定的柱子，样品处理得更干净或者结合运用以上的多种方法。相关的事例让我们看看近来在我们实验室遇到的峰变形问题。在检查一个如图4样品纯度测试的LC-UV色谱图的时候，我们首先发现这样的问题。目标峰的保留时间约为4分钟；5分钟处的峰是在所有样品中都不存在的未知物。两个峰的前半部分都有相似的变形，提示问题可能是分离前在柱头上发生的。基于前面的讨论，