水稻OsDCL3b基因组织表达分析和沉默载体构建.docVIP

水稻OsDCL3b基因组织表达分析和沉默载体构建 　　摘要：采用荧光定量ＰＣＲ方法分析了籼稻９３－１１根、茎、叶和花药中ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表达，发现水稻不同组织ＯｓＤＣＬ３ｂ的表达量存在明显差异，花药中表达量最多，根中表达量最少。重点构建了水稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默载体，通过农杆菌介导转化粳稻中花１１，获得了转基因Ｔ０代阳性植株，为进一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了基础。 　　关键词：ＯｓＤＣＬ３ｂ基因；组织表达；载体构建；基因沉默；水稻 　　中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5788-03 　　Ｄｉｃｅｒ或Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ（ＤＣＬ）蛋白通过产生ｓｉＲＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ＲＮＡ）和ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等小分子非编码ＲＮＡｓ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡｓ，ｎｃＲＮＡｓ）［１］来调控其他相关基因的表达，进而影响真核生物的生长发育、抗病抗虫性和逆境适应性等［２－４］。 　　在水稻中，已报道至少存在８个可能的ＤＣＬ蛋白基因［５］。最初，Ｌｉｕ等［６，７］对ＯｓＤＣＬ１和ＯｓＤＣＬ４进行了功能分析，发现ＯｓＤＣＬ１与ｍｉＲＮＡ的生物形成密切相关，缺失ＯｓＤＣＬ１的生物个体在幼苗期出现发育停滞现象，如植株矮化、叶片卷曲、根扭曲等现象。ＯｓＤＣＬ４主要影响大小为２１　ｎｔ的ｓｉＲＮＡ的生物形成，与拟南芥同源基因ＡｔＤＣＬ４不同的是，沉默或缺失ＯｓＤＣＬ４既影响生物个体的营养生长，又影响生物个体的生殖生长，而ＡｔＤＣＬ４仅影响生物个体的营养生长。随后，Ｕｒａｙａｍａ等［８］的研究表明，敲除ＯｓＤＣＬ２的转基因植株中内源性ｄｓＲＮＡ病毒的含量水平将明显降低，植株表现为矮化和育性降低等。Ｗｕ等［９］证实，ＯｓＤＣＬ３ａ与ｌｍｉＲＮＡ（ｌｏｎｇ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ）的产生密切相关。最近，Ｓｏｎｇ等［１０］进一步报道了ＯｓＤＣＬ４、ＯｓＤＣＬ３ｂ和ＯｓＤＣＬ１的功能；其中ＯｓＤＣＬ３ｂ的功能为首次报道，报道中仅指出了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物学功能是加工??生大小为２４　ｎｔ的小ＲＮＡ，但这些小ＲＮＡ究竟调控哪些相关功能基因的表达，以及相关功能基因的表达变化又如何影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等尚未见报道。基于在籼稻９３－１１花药中获得的ＯｓＤＣＬ３ｂ的全长ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ２０８４０６），采用荧光定量ＰＣＲ方法研究了籼稻９３－１１不同组织部位ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表达差异，并利用ＲＮＡ干扰技术构建了ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默载体，采用农杆菌介导法转化粳稻中花１１，获得了转基因Ｔ０代阳性植株，为进一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因加工产生的各种小分子ｎｃＲＮＡ究竟调控了哪些相关基因的表达、进而影响转基因植株的生长发育、抗病抗虫性或逆境适应性等打下了重要的基础。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料 　　１．１．１ 植物材料、菌种与质粒 籼稻９３－１１和遗传转化所用材料粳稻中花１１种子均由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。用于基因沉默的质粒ｐＹＬ为改造的ＲＮＡｉ－Ｕｂｉ［１１］，由华南农业大学刘耀光教授惠赠。大肠杆菌Ｔop１０Ｆ′、农杆菌ＥＨＡ１０５由南昌大学生命科学与食品工程学院植物遗传研究室保存。 　　１．１．２ 主要试剂 ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、ＰＣＲ反应所用ＤＮＡ聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物ＲＮＡ提取试剂盒、反转录试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶ＢａｍＨⅠ、Ｈｉｎｄ　Ⅲ、ＭｌｕⅠ和Ｐｓｔ　Ⅰ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　１．２ 方法 　　１．２．１ 总ＲＮＡ的提取和正向干涉片段的ＲＴ－ＰＣＲ扩增 按Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＴＲＩｚｏｌ试剂盒提取籼稻９３－１１花药的总ＲＮＡ后，将其反转录成ｃＤＮＡ，再用引物ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｓｉ：５′－ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣ　ＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧ－３′和ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｘｉ：５′－ＣＣＧＧＡＡＧ 　　２ 结果与分析 　　２．１ ＯｓＤＣＬ３ｂ在籼稻９３－１１根、茎、叶和花药中的表达结果 　　２．２ 沉默载体的构建结果 　　２．３ 转基因Ｔ０代阳性植株的鉴定结果 　　３ 讨论 　　前人的研究结果表明，粳稻ＯｓＤＣＬ３ｂ在营养组织中往往低水平表达，在花器官和种子发育初期则高水平表达［５］。本研究结果进一步显示，籼稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在籼稻９３-１１的花药中表达量最高，在其他组织中表达量均较低，尤其是在根中的表达量几乎只有花药中的５０％。由此推