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角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡作用研究 　　[摘要] 目的 研究不同浓度角质细胞生长因子（KGF）对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用，为探讨KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据。方法 将不同浓度的KGF（对照组0 ng·mL-1，实验1组5 ng·mL-1，实验2组25 ng·mL-1，实验3组50 ng·mL-1）分别加入体外培养的口腔黏膜上皮细胞，培养12、24、48 h后，倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响，并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果 1）实验组较对照组细胞贴壁明显，且48 h时实验3组细胞核仁明显。2）培养48 h时，4组之间的细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，细胞凋亡率和Bax mRNA表达逐渐降低，Bcl-2 mRNA表达逐渐升高（P 　　[关键词] 角质细胞生长因子； 细胞凋亡； 口腔黏膜上皮细胞 　　[中图分类号] R 783.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.005 　　细胞凋亡与口腔疾病的发生密切相关[1]。角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）为碱性成纤维细胞生长因子家族的一员，由间质细胞分泌，通过旁分泌的途径作用于上皮细胞。在本课题组前期的研究中，发现KGF与口腔黏膜上皮细胞的增殖和凋亡密切相关[2]，KGF在口腔黏膜上皮的颗粒层及棘层上皮细胞的表达水平较高。本研究将不同浓度的KGF作用于培养的人口腔黏膜上皮细胞，检测其对口腔黏膜上皮细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA表达水平的影响，探讨其在口腔黏膜病的发生、发展及治疗中的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞来源 　　人口腔黏膜上皮细胞系由山东省口腔生物医学重点实验室提供，来源于日本早稻田大学，取第3～10代的细胞用于实验。 　　1.2 主要仪器和试剂 　　改良无血清培养基D-KSFM（GIBICO公司，美国），Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（中国Best-Bio公司），SYBR Premix Ex TapTM[宝生物工程（大连）有限公司]，KGF（Prospec公司，美国），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪ABI7500（Bio-Rad公司，美国），流式细胞仪 EPICS XL（Beckman公司，美国）。 　　1.3 口腔黏膜上皮细胞的培养及鉴定 　　从液氮中取出细胞冻存管后，迅速放???到37 ℃水浴中，轻振荡使其快速解冻。在紫外灯照射30～ 　　40 min并通风10 min的超净台中，将冻存管内细胞悬液移入离心管后加入5～10 mL含10%胎牛血清及1%双抗的培养液。离心800 r·min-1 8 min。去除上清后加入培养液吹打成细胞悬液，接种。在37 ℃、5% 　　CO2培养箱中培养。复苏第2天更换培养液，每3天换液1次，待细胞生长到覆盖瓶底壁80%时传代。 　　口腔黏膜上皮细胞体积较小，贴壁生长，呈扁平的卵圆形或多角形如铺路石状。荧光角蛋白免疫组化标记阳性。 　　1.4 口腔黏膜上皮细胞分组 　　取对数期口腔黏膜上皮细胞进行传代培养，待细胞密度达到70%～80%融合时，加入D-KSFM培养24 h，去除原培养液，根据实验分组分别加入含不同浓度KGF（实验1组5 ng·mL-1，实验2组25 ng·mL-1，实验3组50 ng·mL-1）的D-KSFM，对照组加入等体积无菌PBS（0 ng·mL-1KGF）。 　　1.5 KGF对细胞形态的影响 　　各组细胞培养12、24、48 h后，在倒置显微镜下进行细胞形态学观察。 　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 　　各组细胞培养48 h后，胰酶消化，收集细胞悬液，用预冷的PBS洗涤细胞2次（2 000 r·min-1，5 min）。用400 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度为每毫升1×106个细胞；加入5 μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染液后轻轻混匀，2～8 ℃避光下孵育5 min，1 h内用流式细胞仪进行检测。右上象限（FITC+/PI+）代表晚期凋亡和坏死细胞，右下象限（FITC+/PI-）代表早期凋亡细胞，左下象限（FITC-/PI-）代表活细胞。 　　1.7 荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、BaxmRNA的表达 　　各组细胞培养12、24、48 h后，收集细胞并提取各组细胞总RNA，经RNA浓度及纯度检测后，用逆转录试剂盒逆转录成c