红曲色素与桔霉素的分析_ 福州大学现代教育技术中心课件.ppt

红曲中桔霉素的分析检测 报告人：徐国亮 080300116 桔霉素的理化性质 桔霉素含一个羧基, 有两种形式: 离子态和非离子态(羧基和相邻的酮基及羟基形成分子内氢键) ,其分子式为C13H14O5 , 分子量250。在无水乙醇或苯- 环己烷中结晶呈柠檬黄针状结晶, 溶点: 175 ℃。溶于极性有机溶剂，溶于氢氧化钠，碳酸钠和碳酸氢钠稀溶液.难溶于水。 桔霉素的化学性质 桔霉素的形成机理 在红曲霉培养时,首先由一个乙酰辅酶A 分子和四个丙二酰辅酶A 分子缩合成戊酮,然后分经两条途径:一条途径是此戊酮再与丙二酰辅酶A 分子缩合成己酮,最后生成红曲色素；另一途径是此戊酮经甲基化、缩合、还原、烷基化、还原、氧化、脱水等步骤,最后生成桔霉素。 桔霉素的处理方法：1)加热处理；2)氧化处理；3)微波处理。 红曲色素的分析检测方法 抑菌圈法 抑菌圈法比较简单和直接，可间接定性和半定量确定红曲中桔霉素含量，但红曲中的抗菌物质不止桔霉素一种，而且影响因素很多，因此不够准确。 双向薄层层析 双向薄层层析 展开剂 展开剂 第一相分离红曲中除桔霉素外的其他成分,第二相主要分离桔霉素。采用这种方法可避免其他成分对桔霉素荧光点的视觉干扰。实验结果表明,利用双向展开法,可以检测出红曲中的桔霉素。 具体展开相, 第一相点标准品及样品, 展开剂选择氯仿∶丙酮(9∶1) 。第二相侧向展开, 展开剂选用苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶3∶1),展开结束,晾干。在紫外灯下可见清晰的绿色荧光。根据第二相展开的Rf 值可确定为桔霉素。 红曲样品双向展开示意图 高效液相色谱法 　高效液相色谱法能精确测定红曲中桔霉素含量，采用紫外检测器，需对样品进行预处理和板层析，最低检测浓度为１mg/L；采用荧光检测器，由于桔霉素本身具有在激发态下产生荧光的特性，而其它色素在这一波长范围内不具备激发荧光的条件，因而不需对样品进行预处理，桔霉素的测定也不受干扰，检测结果的重现性好。 各国的桔霉素检测方法 高效液相色谱法 萃取次数实验 比较了ZORBAXEclipse XDB-C18( 5μm ,2 50X4.6mm) ,ZORBAXS BC 　　　　 18( 5μm ,2 50X4.6mm),NUCLEOSIL RP18 (5μm, 250X4.6mm)这三根C18柱对桔霉素定性定量检测的影响。 流动相 乙腈和水不同比例混合，实际上决定了混合流动相极性的强弱。这对于分离不同极性的样品是非常重要的。乙腈和水的比例分别选用了:65: 35, 60:40, 55 :45, 50: 50, 45: 55和35:65(v/v) 流动相pH 根据大多数文献资料，流动相的pH都设定在2.5。这主要是因为，当桔霉素溶液的pH为2.5时，桔霉素呈非离子状态，在荧光检测器检测时信号最强. 在不同的流动相配比条件下桔霉素与其它杂质的分离效果比较 桔霉素的三个最大吸收峰：222.6nm、254nm、325nm 在上 述 优 化的高效液相色谱条件下，用标准桔霉素作最低检测限试验，发现:当其质量浓度为0.05mg/l时,仍能检测到,并基线平稳。色谱图如下 桔霉素抗体的制备 取少量连接物（ 0.1ml）溶于蒸馏水（ 2.9ml）中，280nm测吸光值，求其中蛋白质含量，根据BSA或OV的分子量，算出其摩尔数；同时取等量连接物溶于甲醇溶液中，320nm测吸光值，求出其中桔霉素的摩尔数，计算两者的摩尔数之比。 抗原抗体反应 每孔加入100μL以PBST倍比稀释的抗血清和阴性血清，同时设置空白对照（ 以PBST代替血清），37℃保温保湿2h，PBST洗涤扣干5次。 酶标二抗与抗体抗原复合物反应 每孔100μL的羊抗鼠IgG:HRP酶标二抗（ 以PBST作1:1000稀释），37℃保温保湿1h， PBST洗涤扣干5次。 底物显色反应 每孔加反应底物100μL （ 40mg邻苯二胺溶于100ml，pH5.0，0.1mol/l柠檬酸-0.2mol/l磷酸氢二钠缓冲溶液，再加入150μLH2O（ 现配现用），37℃避光反应30min，每孔50μL，2mol/l硫酸终止反应，5min后以空白对照孔调零，490nm测吸光值。 以抗血清的吸光值2倍于阴性血清的吸光值时，抗血清的最大稀释倍数作为抗血清的效价。 抗体的灵敏度 抗原的包被、封阻、酶标二抗反应以及底物显色反应均同以上，不同之处是仅需将抗原抗体反应改为：每孔加入以PBST稀释的1号抗血清90μL（ 稀释度为1：50），同时分别加入不同稀释倍数的桔霉素甲醇溶液10μ