深部真菌的研究进展课件.ppt

? 直接镜检： B、胶带粘贴法 用透明胶带直接贴于取材部位，数分钟后揭下，充分展平后，直接置贴于加有一滴浮液的载玻片上此液可以是10%~20%的KOH，也可以采用乳酸酚棉蓝染液（易于观察）。该法常用于花斑癣患处的直接检查。 ? 真菌的培养： A、念珠菌培养 ①沙氏培养法: 取标本接种于沙氏琼脂培养基上，分别放置于25℃和37℃恒温箱内48—72h，即有奶油色酵母样菌落生长。将菌落移种到吐温琼脂基（小培养条件下）于25℃24h可产生顶端厚壁孢子,即诊断为白念珠菌。未见厚壁孢子只有假菌丝为念珠菌属，进一步作发酵实验和同化实验，可鉴定为哪一种念珠菌。 ②科玛嘉显色培养法： 将标本接种于念珠菌显色培养基(科玛嘉显色培养基）的表面，37℃24—48h，可有酵母样菌落生长，根据菌落产生的不同颜色来鉴定念珠菌。 ? 真菌的培养： B、系统性曲霉菌培养 ? 如果镜检见到曲霉菌的特点，培养可以直接选用察氏培基，分别放在25℃和37℃恒温培养箱内，3-5天即可生长出完整的菌落。根据菌落的颜色和分生孢子头的结构特征，鉴定曲霉菌种。 ? 结构特征：分生孢子梗、顶囊、产孢结构（瓶梗或小梗）、分生孢子、有性期（壳细胞、闭囊壳、子囊孢子） 白色念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 克柔念珠菌 黄曲霉 烟曲霉 黑曲霉 新型隐球菌 墨汁涂片 组织相 毛霉属 根毛霉 毛霉 犁头霉 镰刀菌 ?真菌感染，不论浅部真菌或深部真菌感染，几乎全部依赖于临床标本的真菌学检查，病原真菌的鉴定主要依靠其形态学。 ?方法：显微镜直接检查（镜检）、真菌培养及鉴定、组织学检查。其他特殊方法，有血清免疫学及分子生物学基因检测法等。 ? 归纳小结 ?真菌药敏试验及真菌药 ?抗真菌药敏 近年来，深部真菌感染的发病率明显增高，新研制的抗真菌药物也不断涌现，而耐药菌株在临床上也不断发生。因此，开展抗真菌药物敏感实验，选择敏感的抗真菌药物是实验室中一个重要的工作环节。 抗真菌药物敏感实验主要是测定抗真菌药物对致病真菌的抑菌或杀菌作用。在最低药物浓度下可抑制全部病原真菌者称为最低抑菌浓度（MIC），有时还判定MIC50（50﹪真菌的MIC）及MIC90（90﹪真菌的MIC）。在最低浓度下可杀死全部真菌者为最低杀菌浓度（ＭFＣ）。 ?真菌药敏试验及真菌药 ?抗真菌药敏 液基稀释法：液基稀释法是美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）分别于1997年和2003年推出了致病酵母菌抗真菌药物敏感试验方案M27-A和产孢丝状真菌抗真菌药物敏感试验方案M38-A。 这两个方案对于致病性真菌的培养基pH值，培养基的成分，接种浓度，孵育温度，时间，终点判断等因素作了明确的规定，使得不同实验室之间的结果客观，具有可比性，因此被称为标准试验方案。 ?抗真菌药敏 1.酵母样真菌药物敏感试验： (1)微量液体稀释法： 美国国家临床试验标准委员会推荐方法（ＮＣＣＬＳ）用96孔微孔板(U型)，每板第一排各孔(12孔) 内分别加入培养基180ul，第11孔为阴性对照，第12孔为阳性对照；加入系列稀释浓度的待测药液10ul依次加入相应药液于各孔内，阴性对照中加入20ul；加入菌悬液10ul，（阴性对照孔不加）；置于振荡板上振荡5分钟，使各液混匀，放入湿合内，于35℃24h。观察结果。 本方法也可加入指示剂于培养基内，菌生长后由兰色转为紫红色，以无色泽变化为ＭＩＣ。 (2)琼脂扩散法： 将待测的真菌掺入琼脂基内，将药敏片置于培养基表面，孵育48h后，根据纸片周围真菌生长被抑制的范围来确定该抗菌剂对此真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度药敏片可测出ＭＩＣ。 (3)纸片扩散法：（试剂盒） 似细菌药敏的方法。将菌株划线接种于培养基表面，放入不同的药物纸片，培养48h，观察抑菌环的大小。同时用不同浓度的纸片，可观察ＭＩＣ。此种方法简单易行，不需要复杂设备，可作为抗真菌药物的初筛方法。 ?抗真菌药敏 (4)鉴定药敏法：（改良法） 采用科玛嘉念珠菌培养基，将临床标本用生理盐水稀释，用棉拭子将标本稀释液划线于培养基表面，再放入药敏片，48h后，产生不同颜色的菌株，同时出现抑菌环，根据抑菌环的大小，确定药物敏感程度，也可进行ＭＩＣ的测定。 ?抗真菌药敏 2.霉菌（丝状真菌）药敏试验： (1)试管药基法： 将药物倍比稀释的方法加入培养基内，然后接种菌种，观察ＭＩＣ。 (2)纸片法： 将培养出的丝状菌（曲霉菌）制成菌悬液，划线接种于培养基表面，放入药敏片，观察药物敏感情况。 ?抗真菌药敏 药敏(微量法) 药敏(琼