真菌漆酶研究进展及其应用前景.docVIP

真菌漆酶研究进展及其应用前景 　　摘要：漆酶生产菌株多为白腐真菌，常用的漆酶活性测定方法有分光光度法、ABTS法、微量热法等，其降解工业“三废”中的有毒有害物质被认为是一种效率较高，成本较低的且最有前途的方法，其对环境保护的研究以逐渐成为国内外研究的热点，本文阐述漆酶的性质、活性中心、结构特点以及其在环境治理方面的应用。 　　关键词：漆酶；结构；活性中心；环境修复 　　中图分类号：X592文献标识码：Ａ 　　基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（项目编号 　　为本文通讯作者漆酶最早由Yoshi从日本紫胶漆树（Rhus　vernicifera）漆液中发现。19世纪末，G.Betranel首次将能够使生漆固化的活性物质进行分离，命名为“Laccuse”，即漆酶。漆酶属蓝色多铜氧化酶家族［1，2］，与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆中铜蛋白同源。人们将自然界中得到的漆酶分为漆树漆酶和真菌漆酶，其中真菌漆酶极具研究价值。漆酶在生物制浆、污水处理、防腐剂、杀虫剂等化工产品的降解效果显著，用于环境保护、环境监测等领域，在食品工业等方面也有应用［3］，已逐渐成为自然科学的研究热点之一。漆酶催化氧化不同种类型的底物已达200余种，广泛用于食品、废水处理、造纸等领域。 　　国内外真菌漆酶研究主要是以担子菌、子囊菌、脉孢霉、柄孢壳菌和曲霉等真菌来研究漆酶的生物学活性，细菌和放线菌的研究较少，现已在细菌生脂固氮螺菌（Azospirillum　lipoferum）中发现了漆酶的存在。而高等担子菌中的研究对象包括白腐真菌、杂色云芝、平菇、变色栓菌，其中白腐真菌所产的漆酶为胞外酶，可作为主要的产酶者和研究对象。 　　１漆酶的性质 　　1.1理化性质 　　漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，不同来源的漆酶铜含量也有所不同，多含有4个铜原子［4］。漆酶多为1条多肽链组成的单聚体，由500～550个氨基酸分子所组成，相对分子质量主要集中在50～80kD，其碳水化合物约占15％～20％，等电点pI为3～6，反应温度为30～60℃，pH低的环境，漆酶的生物活性较高［5-7］。 　　1.2活性中心 　　漆酶催化中心根据其光谱性质，存在3种不同的功能： 　　1.2.1Ⅰ型铜 　　含铜的蓝色蛋白质，Ⅰ型铜与2个组氨酸和1个半胱氨酸配位，紫外可见光谱λ=600nm时出现峰值，在EPR（电子顺磁共振）谱上有1个平行超精细耦合结构，Ⅰ型铜参与分子内的电子传递，将电子从底物传递到其它铜原子上。 　　1.2.2Ⅱ型铜 　　II型铜与2个组氨酸和1个水分子配位，形成T型几何结构，没有明显的可见吸收光谱，但有EPR（电子顺磁共振）信号。 　　1.2.3Ⅲ型铜 　　与漆酶的催化作用密切相关，经实验研究其为活性中心，由2个铜原子通过1个-OH桥配位连接起来组成四面扭曲的四方立体双核铜区结构，铜原子之间具有抗磁性，其距离是0.38nm。在紫外可见光谱λ=330nm处有最大吸收峰，在EPR上无谱带［8～14］；为了测定漆酶活性中心，将其经过抑制剂处理后，Ⅲ型铜在EPR上出现有裂分峰，表明外源性配体与Ⅲ型铜发生了配位，1个Ⅱ型铜和2个Ⅲ型铜形成三核铜簇，双氧还原的反应位置在三核铜簇，此时Ⅲ型铜已结合5个配体，使其氧化性降低，限制了还原，同时也抑制O进入三核中心区。 　　另有实验表明，将漆酶晶型结构被完全还原，Ⅰ和Ⅱ型铜的配位环境不变，Ⅲ型铜的-OH桥配体则在反应中消耗，2个Ⅲ型铜之间距离亦增加［15］。 　　1.3检测方法 　　检测漆酶活性方法有分光光度法［16］、ABTS法、微量热法、测O2法、高效液相色谱法［17］、极谱法［18］等。ABTS法测定漆酶，常用醋酸钠溶液作为缓冲溶液，反应体系内ABTS的浓度为0.5mmol/L。漆酶对不同种底物的亲和力也有显著地差异，但其对ABTS的亲和力和催化能力普遍很高，测得的酶活性值也高，此方法反应条件不高，使用安全，常温下性质稳定，测定的OD值相对稳定而准确［19］。微量热法测定漆酶的活性，利用LKB-2107Batch型微量热系统，将其温度调至298K，pH调至7.4，此方法漆酶的提取物样品用量较少，可直接对酶的悬浮液进行测定，其对反应体系没有任何限制或干扰，适合研究酶促反应中的酶活。分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物，底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基，底物自由基浓度与吸光值成正相关，其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值，依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。分光光度法因其操作简单、快速、较准确、无需配备昂贵仪器设备等特点，得以在漆酶测定实验中广泛应用［20］。 　　2漆酶的应用 　　2.1工业污水治理 　　真菌降解木质素目前主要集中于生物制浆方面。传统