(总论)5中药鉴定技术四大方法2.ppt

白头翁 委陵菜 新技术、新方法简介 1. DNA分子遗传标记技术； 2. 中药指纹图谱鉴定技术； 3. 高效毛细管电泳技术； 1、DNA 分子鉴定Identification of TCM by DNA Molecular Marker 20世纪90年代中后期开始； 解决形态鉴定的某些局限； 同属多来源药材的鉴别 道地药材的鉴别等 PCR (Polymerase chain reaction) PCR fragments Interested DNA sequences Primer Primer Identification of TCM by DNA Molecular Marker Extracts Genomic DNA TCM materials DNA sequencing 寻找特征性基因 PCR-RFLP DNA Chip Diagnostic PCR 高等植物中nrDNA基因重复单位的基本结构，P1、P2为PCR扩增的两引物 18S r DNA ITS ITS Spacer region AS AS-1 5S-rRNA Coding region Coding region 在高等植物中，5SDNA是编码5S核糖体RNA的多拷贝基因，以串联重复的形式存在，每个重复单位包括一个大约120bp的编码区和长度在100~700bp之间的转录间隔区 核糖体DNA(ribosome DNA,rDNA)基因片段 中药鉴定常用的基因 F.unibracteata F.cirrhosa F.przewalskii F.thunbergii 浙贝母 川贝母及其伪品浙贝母幼小鳞茎的性状和显微特征 两者性状和显微特征难以区别 浙贝母的鉴别性PCR鉴定 上游引物：Fth-P3: 5’- GGT GAG ATT AGA TCA TAA TTT CGG TG -3’ 329 下游引物：Fth-P2: 5’-TAT TAG CAT TAA TCG ATC GAA TTC-3’ 522 基于5S-rRNA 基因间区序列: 152(P1);522(P2);329(P3);505(P4) 300 400 500 FthP2、P3于60℃的扩增 243 M：100bp Ladder DNA 分子量标记， 1 浙贝母 2 东贝母 3 平贝母 4 伊贝母 5 新疆贝母 6 蒲圻贝母 7 蒲圻贝母 8 湖北贝母 9 梭砂贝母 10 暗紫贝母 11 甘肃贝母 12 卷叶贝母 13 紫花贝母 14 绿黄贝母 15 康定贝母 浙贝母 川贝母类药材的PCR-RFLP鉴定 nrDNA ITS区(含5.8S) 序列全长610bp 川贝类特异性序列: 5’- TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC–3’ 非川贝类 T 75bp ITS1区序列全长212bp 200 300 400 ITS1区SmaⅠ酶7 118 190 308 川贝类 川贝母 暗紫贝母 甘肃贝母 梭砂贝母 基于5S-rRNA基因间区序列 HinfⅠ梭砂贝母;BcnⅠ暗紫贝母 Primer Premier  金银花存在明显的道地性，同一物种产地不同质量差异明显 金银花道地药材的鉴定 金银花ITS区序列全长（含5.8S）616bp, 变异位点： 道地： GCCCCCCCGCCCCGCCTCCCACAGGGTCGCG 非道地： GCCCCCCCGCCCCGCTTCCCACAGGGTCGCG 近缘种 　 　　　　　　　　　　 EcoNI 458bp 458bp 不同产地金银花及其近缘种PCR-RFLP分析结果 500 400 3008 708 461 247 A1为河南封丘，A2为河南新密，A3为山东平邑，A4为山东费县；B1为江苏南京，B2为湖南溆浦，B3为广东广州，B4为贵州贵阳，B5为重庆武隆，B6为云南昆明；C1为山银花，C2为毛花柱忍冬，C3为红腺忍冬 道地 非道地 近缘种 EcoNI Primer Premier The major 5?-cevane isosteroidal alkaloids in Beimu  中药贝母中含有的主要活性成分 川贝;新贝 湖贝;浙贝 To control active compounds (alkaloids) by TLC fingerprints I 伊贝母药材薄层色谱图 1、2阴性对照 3.西贝素甙对照品 4. 西贝素对照品 5. 样品990120yc 6. 样品990406yc 7. 样品9909