原位杂交20061.pptVIP

* 原位杂交 In situ hybridization (ISH) 王海龙 2006.03 肺泡巨噬细胞TGFβ1原位杂交染色DAB× 200 支气管上皮细胞TGFβ1原位杂交染色DAB× 200 第一节 原位杂交概述 一、概念 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），属于固相核酸分子杂交的范畴。是应用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸（ mRNA ）按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，在核酸原有的位置进行细胞定位和定量。 二、原位杂交与其他杂交技术的区别 菌落杂交：细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交； Southern杂交：是鉴定DNA中某一特定的基因片段； Norhtern印迹杂交：是检测某一特定的RNA片段的。 它们都只能证明细胞或组织中是否存在待测的核酸，而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位和数量。 三、原位杂交的历史 1969年美国耶鲁大学Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 同时，Nardelli、John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 第二节 原位杂交技术 一、杂交前准备 （一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水 DEPC即二乙基焦碳酸酯，可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。 原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。 终浓度一般为0.1%～0.4% 注意：①DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。 （二）固定 1、目的：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。 2、固定剂：4%多聚甲醛 对于mRNA的定位，常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中用恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。 （三）玻片的处理 1、清洗 （1） 泡酸 清洗 160℃以上烤箱中烘烤4h以上或经15磅高压灭菌20min （2）HCl处理法 2、包被 多聚赖氨酸 铬矾-明胶液 APES（氨丙基三乙氧基硅浣） （四）杂交前操作 1、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 稀释的酸洗涤 清洗剂Triton X-100 酒精 消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶 2、预杂交（Prehybridization） 是减低背景染色的一种有效手段。 预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。 将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 ※：临用前加；△予杂交液不加 （一）原位杂交用探针的分类 1、根据标记方法的不同可分为放射性探针和非放射性探针。 1、放射性探针：同位素标记（发射性、半衰期） 2、非放射性探针 荧光素 DNP 磺基化DNA探针 生物素 地高辛 二、杂交 2、根据探针的核酸性质分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针 寡核苷酸探针 4、探针的浓度 ：0.5～5ng/μl 3、探针的长度 ：50～100个碱基 （二）杂交的温度和时间 原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃，而RNA探针需要95℃。 杂交液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。因此，杂交液中加入30%～50%甲酰胺。实际采用的原位杂交的温度在Tm-25℃左右，大约在30～60℃之间 。 一般杂交反应时间为16～20h 。 在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。 甲酰胺可降低Tm值，防止在低温时非同源性片段的结合。 （三）杂交后处理 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。 必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。