第六章 分类资料的统计描述及简单推断及SAS过程.pptVIP

 Western blot 技术 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 细胞裂解液 蛋白的提取 用预冷的PBS漂洗细胞两次，弃洗液并吸尽残余液体。 加入细胞裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠，将裂解产物吸入1.5ml离心管。整个过程必须在冰上进行,防止蛋白降解。 超声剪切染色体DNA,直至溶液不再粘稠为止。 超声的频率，时间，次数，不能起泡沫，探头应插入液面以下。 4度离心机离心，10000rpm，10分钟 (或12000rpm,2分钟)。分三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 将上清移入另一Eppendorf管，存于-80°C冰箱保存。 加入蛋白上样缓冲液并置于沸水浴中加热3-5分钟，变性待用。  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 凝胶成份 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? 避光，保存时间 SDS Tris-Cl 缓冲液 TEMED 避光 过硫酸铵 保存时间 去离子水 操作图示 配胶注意事项 western常用胶为不连续、变性SDS-聚丙烯酰胺胶，上层为浓缩胶，下层为分离胶。 配制分离胶用水封液面时，注意加水需轻柔,沿玻璃缓缓流下,而不能砸下,保持分界处的平直,以及交接面不会被水所稀释,影响蛋白分离效果及条带的美观性(也可以用异丁醇)。 引发剂及增速剂用量需适当，胶凝聚的时间控制在30min到1h为宜。 在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入干净梳子，小心避免混入气泡。 凝胶浓度与蛋白分离范围 蛋白marker 胶的染色 转膜 聚丙烯酰胺胶-膜三明治 膜的染色 丽春红染色 可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照 氨基黑染色 不可逆，灵敏度为30ng/条带 印度墨汁染色 不可逆，灵敏度为6ng/条带 胶体金染色 灵敏度最高，400pg/条带 封闭液 脱脂奶粉（5％） BSA（3%） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 封闭注意事项 封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。 可4度过夜或在常温1h。 尼龙膜及PVDF膜可适当延长封闭时间。 奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。 也可用3%明胶封闭。 一抗、二抗孵育 将膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃ 2-4小时或4 ℃过夜。 用TST洗液洗膜3次，每次10min。 加入用TST配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 常温 1小时。 用TST洗液洗膜3次，每次10min。 抗体的结合 常用抗体品牌：Cell Signaling，RD，Chemicon，Rockland，BD， Santa-cruz， Sigma。 抗体需分装，冰冻保存，避免反复冻融。 一般抗体可反复使用两次（一周内）。 抗体浓度过底则检测不出条带，但浓度高了也不行，一抗浓度过高易产生杂带，二抗浓度过高易发生背景，要在“平衡木”上保持平衡，找到一个平衡点。 也可用洗脱液的盐离子浓度高低、洗膜时间长短，及洗膜力度的大小来调节抗体的结合程度。 二抗与底物显色反应 辣根过氧化物酶法（HRP） 10-20pg 碱性磷酸酶法（AP） 10-50pg 化学发光显色法 显色反应、曝光 我们通常使用的试剂盒是Amersham 的ECL plus。 新鲜配制发光工作液，A：B为40：1 用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。小心在膜上滴加ECL混合液，孵育3-5分钟，立即压片曝光，正常强度时肉眼可见荧光。 将膜沥干发光液后，夹入塑封膜，置于压片盒中（内贴增感屏），黑暗