从RNA提取到荧光定量PCR的解决方案课件.pptVIP

神经生物学科研中心 分子生物学平台 张宝乐 “从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案 一、RNA提取及反转录 样品收集 提取RNA 的样品要保证“新鲜” （屠宰后，立即放入液氮，过夜后转入-80℃冰箱） RNA提取 防止RNA酶的污染：DEPC处理 150-180 ℃烘烤3-4h Trizol-氯仿（氯仿-异戊醇49:1）-异丙醇-75%乙醇 试剂盒（离心柱滤膜吸附法） 提取方法： RNA 检测 甲醛变性电泳: 三条带（28、18、5.8/5S） 紫外吸光值检测： OD260/280 (1.8-2.0) （＜1.7蛋白质或酚污染；＞2.1异硫氰酸残存或降解） OD260读数（0.1-0.5） (线性关系好) RNA得率=OD260*稀释倍数*40ng/µl 反转录 模版： 总RNA、mRNA、体外转录的RNA 引物: oligo（dT）、随机引物、基因特异引物(GSP) 利用普通PCR初筛定量引物 特异性、避免产生引物二聚体 产物长度90-300bp之间 退火温度：60℃左右（内参和目的基因一致） 考虑目标剪接体（若基因存在可变剪切） 尽量跨内含子设计引物 Real-time PCR 检测 确定引物的有效性（扩增曲线、熔解曲线、标准曲线） 二、 Real-time PCR 荧光定量PCR原理－－常用名词概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 NOTE: 采用 72℃延伸时采集荧光! 95 ℃ 60 ℃左右 NOTE:质粒获得后，用限制性内切酶单酶切，使其线性化！ 或者使用纯化的PCR产物。 NOTE: 稀释液可采用专用的定量PCR稀释液，如EASY DILUTION 标准曲线的线性关系不佳可能的原因： 1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度； 2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融； 3.引物或探针不佳：重新设计； 4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 PCR过程中经常出现的几个问题分析 Ct值出现过晚（30）： 阈值设计过高； 反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等； PCR各种反应成分的降解或加样量不够； 扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。 阴性对照出现明显的扩增： 荧光 PCR mix 或水被污染； 气溶胶的干扰； 引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析。 PCR结果的重复性不好： 加样不准确； 仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好； 模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 扩增效率低： 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法； 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。 荧光定量PCR Ct值一般在多少后认为模板没扩增： 当进入对数期的循环数大于35时，Real time RT-PCR检测无效，基因没有表达； 当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。 The end！ Thank you！