单克隆抗体 疾病诊断PPT课件.ppt

单克隆抗体 中文名称： 单克隆抗体 英文名称： monoclonal antibody;McAb;mAb 定义1： 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞。 应用学科： 免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） 定义2： 只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。 应用学科： 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） 定义3： 由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度抗体。 应用学科： 细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） What单克隆抗体 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 How制备单克隆抗体 1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。 5）克隆化 6）细胞的冻存与复苏 7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。 单克隆抗体的提纯＆保存 一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲和层析法。 　　单克隆抗体的保存 由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。 杂交瘤技术 检验医学诊断试剂 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定 病原体测定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒 细胞表面CD测定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定： 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM)： 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛 免疫沉淀 MACS 二、蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。 三、小分子抗体的应用 定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系 四、抗体融合蛋白的应用 肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断