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PCR法获取目的基因 农学112班 马晴晴 孙婷婷 张 娜 金漪倩 胡 斐 徐振鹏 PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望 PCR技术 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。 在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。 一、PCR技术的创建 1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 二、 PCR技术的原理 1. PCR技术 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。 PCR原理 （1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在 （3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。 （2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个基本反应步骤构成 ①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链； ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； ③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ TaqDNA聚合酶 94℃ 5min 2. 基本程序 PCR排管 Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+ 循环仪 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72 ℃ 5～7 min 循环25～35次 扩增出的目标基因 琼脂糖凝胶电泳 转移点样 进行电泳 扩增出的目的基因 3. PCR反应条件 循环参数 （1）预变性：94 ℃ 5 min （2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 （3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 ℃ 5 min—10 min PCR技术的注意事项 1.合理分隔实验室　将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪　由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装　所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染　一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 四、PCR法获取目的基因 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。 1. T载体克隆PCR获取的目的基因 具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR 产物是平末端,