2012年秋季期 生化理论授课件5 酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质.pptVIP

* 一、实 验 目 的： 1. 通过本实验使学生掌握电泳的基本原理 2. 学会薄膜电泳的基本操作 3. 掌握血清中不同蛋白质的分离方法 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 二、实 验 原理： 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。 方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。 电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白、α1-球蛋白、 α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白。 经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。 三、实 验 方法： 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿和选择 将2.0cm×8.0cm薄膜放入缓冲液中浸泡20min，整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。 2. 制作电桥 将巴比妥缓冲液(pH=8.6)倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 3. 点样与电泳 取出浸透的薄膜，平放在滤纸上(无光面向上)，轻轻吸去多余的缓冲液。用点样器蘸取血清，“印”在薄膜的点样区（如图示），点样区要呈粗细均匀一直线。 将点好样的薄膜两端紧贴在电泳槽支架的滤纸桥上，无光泽面向下，点样端置负极，接通电源，电压160V，电流0.4~0.7mA/cm膜宽，电泳25min。 三、实 验 方法： 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 点样区 5.5cm 2.5cm 4. 染色与浸洗 电泳完毕后，切断电源，用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑10B染色液 中，10min后取出。再浸泡于漂洗液，反复漂洗，直至背景无色为止。 5. 结果判断 一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为： 清蛋白、 α1-球蛋白、 α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白。 6. 透明 将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液中，2min立即取出，紧贴：在 载物片上，赶走气泡。完全干燥后，薄膜完全透明，可作扫描描或照相，将 该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分，可长期保存。 三、实 验 方法： 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 三、实 验 方法： 实验四、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 三、实 验 方法： 实验四、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 三、实 验 方法（简要）： 实验五、醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 1.浸泡20分钟（强调浸泡前辨认光滑面和非光滑面并做上记号；浸泡时制作电桥和练习点样） 2.点样（点样前先用吸水纸吸取多余的水分，然后将样品点在非光滑面上距边缘2－3cm处；一次成功，点样要匀且细，这是实验成功，即图谱是否清晰的关键） 3.电泳（点样端靠近负极，调电流0.6mA/cm膜宽；30分钟。强调稳流。 4.染色（浸泡10分钟） 5.漂洗（少量多次漂洗，至背景无色后浸于蒸馏水中观察血清蛋白色带 6.绘图：图中要表示出血清蛋白的种类、名称、含量和在图谱上的位置等。 实验报告：叙述实验的操作技术；绘图表示试验结果（绘血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱）。 清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 pI 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3 泳动度(cm2/s.v) 5.9×10-5 5.14×10-5 4.1×10-5 2.8×10-5 1.0×10-5 分子量(kD) 69 200 300 90-150 156-300 参考资料 一、试剂 (1)新鲜血清(无溶血现象) (2)巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6)称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于少量蒸馏水后定容1000ml。 (3)染色液 称取氨基黑10B0.5g，加入蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰醋酸10ml，混匀，贮存于试剂瓶中。 (4)漂洗液 取95％乙醇45ml，冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。 (5)透明液 冰乙酸25ml，95％乙醇75ml混匀。 (6)洗脱液 0.4mol/L NaOH。 二、器材 电泳仪、电泳槽、乙酸纤维素薄膜、点样器、滤纸、剪刀、镊子。 实验试 剂 和 器 材