原理及特点检验科PPT课件.pptVIP

聚合酶链反应;聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 ;目 录;PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 ;1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供几种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 ;PCR的改进与完善　 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是： ①Klenow酶不耐高温，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。;;PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量的计算： Y＝(1＋X)n Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。;反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物 的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性 增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。 大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 ;标准的PCR反应体系;PCR反应五要素;1.引物;①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的 嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶 切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；;目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100μl时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。;dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是 注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或 偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低;4.模板（靶基因，target gene）;;PCR反应条件的选择;① 变性温度与时间;退火温度是影响PCR特异性的较重要因素； 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞； 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度； 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。;复性温度=Tm值（解链温度）-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合;延伸温度：一般选择在70～75℃