电泳技术专教学讲座.ppt

电 泳 技 术 琼脂糖凝胶电泳技术 实验室常用琼脂糖有常熔点和低熔点两种类型。 低熔点(LMP)可用于DNA片段的回收。由于其凝胶中无抑制酶 ，可在凝胶中进行酶切、连接。 DNA电泳影响因素 1 DNA分子大小 2 DNA分子构型 一般，质粒DNA分子超螺旋的最快、线状分子次之、开环分子最慢。 3 凝胶浓度 对于 小片段DNA分子的分离采用高浓度的凝胶分离，对于大片段则用低浓度的凝胶。 DNA电泳影响因素 4 电场强度 电场强度高，电泳速度快，但分辨率低。 5 EB 6 电场缓冲液 TAE Tris-乙酸 TBE Tris-硼酸 TPE Tris-磷酸 50×TAE Buffer 配制方法 1. 称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2. 向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3. 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4. 加去离子水定容至1L后，室温保存。 10×TBE Buffer配制方法 1.称量Tris 108g，Na2EDTA.2H2O 7.44g，硼酸55g 于1L烧杯中； 2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀； 3.加去离子水定容至1L，室温保存。 操作步骤： 1 凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶 称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB 溶液。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2 加样 取10μl DNA样液与 2μl 上样 buffer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3 电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 观察拍照 聚丙烯酰胺凝胶电泳 45%的聚丙烯酰胺1000ml 丙烯酰胺 434g 甲叉双丙烯酰胺 16g 加600mlddH2O在37℃溶解，最后定容到1000ml. 9%的聚丙烯酰胺凝胶150ml 45%的聚丙烯酰胺 30ml 20×TBE 7.5ml ddH2O 48ml 尿素 63g 以上在37℃溶解，然后预冷到4℃，再加入1.6%AP(过硫酸铵)5ml和TEMED(四甲基乙二胺)75ul。 0.2%的银染液500ml 取硝酸银1.0g加超纯水充分溶解，然后定容到500ml,避光、低温保存备用。 显影液400ml NaOH 2g 四硼酸钠 0.08g 甲醛 1.6ml 聚丙烯酰胺电泳基本步骤： (1) 首先用自来水沾上洗涤剂把两块玻璃板擦洗干净，然后用蒸馏水冲洗，干燥后用无水乙醇仔细擦洗一遍，待酒精完全挥发后就可以制胶板。 聚丙烯酰胺电泳基本步骤： (2) 将两块玻璃板固定在电泳槽中，通过调整旁边的螺母使玻璃板受力均匀，向电泳槽中倒入少量的缓冲液检查是否漏液。 (3) 取50ml的9%变性聚丙烯酰胺胶液，用针筒将胶液缓缓注入两个玻璃板的夹层中，然后从灌胶口将梳子轻轻插入到合适位置，用吹风机吹热风以加速其凝固，在其凝固过程中，注意补充胶液。 (4) 将电泳槽装配好后，向槽中灌0.5XTBE，用吸水纸将电极擦干，以防止电泳时短路，恒电压350V预电泳30min. (5) 将梳子小心拔出后就可以点样，每孔点样15μL。恒电压450V电泳3～4h至二甲苯青为胶板的2/3处，在电泳过程中要确保胶板温度不高于50℃以免玻璃板破裂。 (6) 电泳结束后，先将缓冲液倒出，再将玻璃板从电泳槽取下。然后小心地将胶板移入去离子水中，轻摇漂洗两次，每次1min。 (7) 倒入0.2%的AgNO3