生化年研究生验2 PCR检测apoB基因多态性.ppt

（三） PCR反应条件 PCR循环的温度和时间（变性、退火、延伸） PCR循环的次数和平台效应 （1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性时间↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于引物Tm值：Tm值=4(G+C) ＋2(A+T) ； 复性温度=Tm值-(5～10℃) ，一般在45～55℃ ； Tm↑退火T↑，Tm↓退火T↓ ； 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3) 延伸：72 ℃ 1min/kb（10kb内） 一般：40－60sec 温度和时间 平台效应 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、底物的消耗、 DNA聚合酶活性下降及非特异性产物的竟争等因素，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，大多数情 况下，平台期(Plateau phase )的到来是不可避免的。 Plateau phase in PCR apoB基因PCR反应体系和反应步骤 体系 25 ?l Mix 12.5 ?l 引物 2 ?l ddH2O 6.5 ?l 模板 4 ?l 步骤 温度 时间 预变性 94 ℃ 5 min 变性 94 ℃ 1 min 退火+延伸 60 ℃ 4 min 延伸 60 ℃ 10 min 35 cycles 循环数 （四） PCR 的特点 操作简单 省时：1-2 hr 灵敏度高：pg 特异性强 对原始材料质量要求低 有一定程度的单核苷酸错误掺入 适用于克隆序列清楚的基因 （五） PCR的应用 1．遗传病的产前诊断：如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏； 2．致病病原体的检测 ：对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。； 3．癌基因的检测和诊断：白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达； 4．DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证：肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究 ； 5．动、植物检疫：检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等 ； 6．高科技生物医学领域中的应用　在转基因动植物中检查植入基因的存在。 7. PCR技术尚可应用于基因拼接、测序等领域。 参考书目 PCR技术实验指南 黄培堂 等译，1998年6月第一版，科学出版社 PCR技术实验指南（第二版）（影印），Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler，2003，Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press，科学出版社 PCR传奇——一个生物技术的故事，保罗 拉比诺 潘涛 等著，朱玉贤译，1998-12第一版，上海科技教育出版社 三、基因多态性 (genetic polymorphism) 基因多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele）。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 1 基因多态性产生的原因 单个核苷酸的点突变即核苷酸的替换 单一DNA序列的插入或缺失 整串DNA序列的插入或缺失 基因转换 2 基因多态性类型的检测 （1）限制性片段长度多态性(RFLP)标记：由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。 （2）随机扩增多态性(RAPD)标记：RAPD是通过短的随机引物扩增个体基 因组DNA体现多态性。 （3）扩增片段长度(AFLP)多态性标记：AFLP是将PCR技术与RFLP结合的一种方法，通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。 （4）微卫星多态性标记(SSRP)：基于PC