分子医学实验论 .ppt

实验室规则 （五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。 （六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。 （七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。 （八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。动物尸体应放入指定的容器中。 （九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。 （十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。 第八次设计性实验课安排 分组方案：4人一组（无法组队同学加入其它组） 答辩ppt内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式，实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释 答辩安排： 第五周将答辩ppt电子版本给老师，答辩日每组时间控制为20分钟演讲，10分钟提问 设计性实验题目： 1 免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。 2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。 5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin)并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 8 细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达量。 实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告： 实验报告首页：实验名称（The title of experiment ）；姓名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期等。 正文：①原理（Principle）；②操作步骤（Operational procedure）；③实验结果（Results）：包括照片、原始数据、计算过程及图表等；④讨论（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。 动物细胞蛋白质的提取和含量测定 蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能研究，是生命科学的核心问题。 要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质相关研究中的必备技术。 基本原理 动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。 采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。 基本的防范措施是尽可能缩短提取时间和在尽可能低的温度下进行提取。 为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。 例如加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶； 胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶； 乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金属蛋白酶。 为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。 考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度的EDTA。 目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。 其中Bradford法和Lowry法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍。 上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 Lowry法： 该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。 由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin－酚试剂形成蓝色复合物。 上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。 考马斯亮兰法： 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 染料主要是与蛋白质