分子生物学201五年制万敏2015092301.ppt

总之，自然界DNA重组有同源重组、位点特异性重组和转座重组三类，位点特异性重组可以诱导DNA片段的整合、倒转或删除，转座重组是DNA片段在染色体中的移动。 * * * 咱们再看第二个特点；切割方式及末端特征！ 这是ECORI 的识别序列，只能切割G-A中间的3’-5’磷酸二酯键，切开后我们发现，被限制酶切开的DNA带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端，简称黏端。也就是说，限制性核酸内切酶切割双链DNA分子后产生黏端。 * 还有一种情况，也有一些限制性内切酶比如smaI是在识别位点序列的中间切割，这样呢，产生了两条链具有平齐的末端，称作钝性末端（blunt end），简称钝端或平端。切割双链DNA分子后也可产生平端。 * 用图示的方法观察DNA连接酶的缝合作用！ 这是ECORI 酶切后的片段，只有有互补的粘性末端才能结合，两个DNA片段通过碱基互补配对结合在一起。但是我们知道两个碱基之间氢键 结合力较弱。那么让后在用DNA链接酶连接双链DNA中的DNA单练缺口，形成3‘5’磷酸二指键.将两者DNA片段连接到一起。这个就是DNA连接酶的缝合作用。 * 既然是外切酶，从外部来切割DNA分子。3’?5’外切酶活性，就是沿着DNA3’?5’的方向从外部来切割DNA分子。比如，当DNA合成掺入不配对的碱基时，当掺入A碱基时，外切酶的活性将该碱基切除，在利用DNA聚合酶的活性加入Dctp. 由于该酶活能够沿着3’-5’方向切除不配对的碱基，重新合成DNA。所以具有纠错功能。 * * * * * * * * * * 2、常用克隆载体 （1）质粒(plasmid)：最常用的克隆载体 广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中 独立于宿主细胞染色体外，环状双链DNA(1～200 kb) 能在宿主细胞内独立自主复制 质粒的不相容性 在同一个细胞中，同类质粒不能并存的现象。 （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 质粒的不相容性 有相同复制起始区的不同质粒，不能稳定共存于同一宿主细胞。 （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （1）质粒(plasmid)：最常用的克隆载体 ①pBR322质粒载体： A、含有一个复制原点ori B、5种常用内切酶的单一切点 C、两个筛选标志抗四环素基因(tet)和抗氨苄青霉素基因(amp)。 （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （1）质粒(plasmid)：最常用的克隆载体 ② pUC18/19质粒载体： A、pBR322的复制起点(ori) B、Amp基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点 C、lacZ`基因替换Tcr基因 D、在lacZ`基因内部有一段MCS （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （1）质粒(plasmid)：最常用的克隆载体 ③ TA克隆载体 A、PCR产物在Taq酶的非模板依赖活性作用下，于3`端加一非配对的A。 B、故可研制一种线性载体，其5`端各带一不配对T，可直接与PCR产物以TA连接进行克隆，即TA克隆。 （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （1）质粒(plasmid)：最常用的克隆载体 A A dNTP T T dTTP Taq DNA聚合酶 载体 目的基因 TA TA （2）λ噬菌体克隆载体 λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点) （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 cos cos 12bp 12bp 48500bp Nonessential portion for replication Long (left) arm Short (right) arm 非必需片段位于λDNA的中部，删除后并不影响噬菌体侵染大肠杆菌的能力。 λ噬菌体进行病毒包装时，要求λ DNA长度是野生型基因组的75%－105%。 （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （2）λ噬菌体克隆载体 cos位点:两端各有一条由12个碱基组成，彼此完全互补且5’突出的序列 插入型：λgt系列，可插入7Kb,适用于cDNA克隆 置换型：EMBL系列，可插入20Kb，适用于基因组DNA克隆 cos cos 12bp 12bp 48500bp Nonessential portion for replication Long (left) arm Short (right) arm （一）克隆载体用于外源DNA的克隆 2、常用克隆载体 （2）λ噬菌体克隆载体 ①黏粒（cosmid）： 由λD