小鼠骨髓染色体制备与观察 医学实验课件.ppt

小鼠骨髓染色体制备与观察 实验目的 掌握动物骨髓细胞染色体制片技术 观察小鼠中期染色体的形态特征并对染色体计数 实验材料及流程 小鼠 2n=40 秋水仙素处理-收集骨髓细胞-低渗处理-固定-滴片-染色-水洗-镜检 秋水仙素处理（已完成） 目的：抑制纺锤丝形成，增加中期分裂相细胞的比例 方法：腹腔注射0.01%秋水仙素溶液 0.5ml 等待2-4h 处死 每四人领取一只小鼠 抓住小鼠尾巴将其转移到实验台上 颈椎脱臼法：一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾靠近根部用力向后拉。将脊髓与脑髓拉断。 注意小鼠咬手，缓慢加力 解剖 剪去腿部附近皮毛，取出股骨胫骨，剃去周围肌肉组织。 收集骨髓细胞 剪去骨两端，注射器吸生理盐水（0.85% NaCl溶液） ，针头插入骨腔反复冲洗几次，用1.5ml离心管收集骨髓细胞。 不要多次重复吸取含有细胞的生理盐水，总体积不要超过1.5ml 离心 离心条件：2000rpm 5min 注意用相同溶液配平 用注射器小心吸取上清，弃去。离心管内可以留少许液体 低渗处理 目的：使细胞内张力增大，细胞更容易破裂，染色体更分散。 低渗液配方：0.075M KCl溶液 离心收集细胞，去上清。 加入1.5ml 37℃低渗液，振荡(轻弹管壁)使细胞分散，在37 ℃培养箱中保温低渗30min，做好标记。 固定 目的：终止细胞生长过程及一切生理生化反应，维持细胞结构不变。 固定液配方： 甲醇：乙酸=3:1 离心收集细胞，去上清。 沿管壁缓慢加入1.5ml固定液，离心2min，去上清。 加入1.5ml固定液，振荡使细胞分散，室温固定30min 重悬 离心收集细胞，保留150ul固定液（可根据细胞量调整）. 振荡使细胞分散 滴片 目的：使细胞膜破裂，细胞核或核内染色体分散在载玻片上 方法：从40cm以上的高度将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，滴两滴（载玻片1/3 和 2/3处）。滴加悬液时载玻片可适当倾斜（30度角），滴完后立即用嘴吹散细胞 空气干燥 注意：用废片和水练习动作 冰片表面用滤纸擦拭干净 染色-水洗-镜检 染料：石碳酸品红 染液覆盖所有细胞，载玻片下垫纸巾 染色5min 水洗：用较小的水流冲洗载玻片背面，流水将从载玻片边缘带走染液 滤纸擦干载玻片背面水分，空气干燥，无需盖玻片，镜检 10倍镜下锁定目标细胞，40倍镜下观察染色体 中期分裂相特点 染色体浓缩成棒状，着丝点在染色体末端 可见三种形状的中期染色体 结果展示 注意事项 安全：老鼠咬手、染液和固定液不要接触皮肤 离心前注意配平 标记自己的样品管 水洗过程中要时刻记住载玻片的样品面和背面 待玻片完全干燥后再镜检 课堂及实验报告要求 课上完成实验记录（实验步骤，现象），教师签字 课后补充完成全部实验报告（目的，原理，结果，讨论等其他细节） 实验结果的要求：中期染色体照片，尽量找分散度适中、染色体数目完整、背景干净的区域拍照。记录照片内的染色体数目。 讨论部分：针对实验过程细节及个人实验结果自由讨论、禁止抄袭！ 下次课统一由班长上交 * Company LOGO 每人一节腿骨 *