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氯霉素免疫抗原合成与鉴定 　　摘要 采用重氮法，将氯霉素（CAP）与牛血清白蛋白（BSA）连接，制备人工免疫原CAP-BSA，经紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验证实人工免疫抗原合成成功，研究结果对氯霉素多克隆抗体和单克隆抗体的制备具有重要意义，并为快速、简便检测饲料中氯霉素含量提供科学依据。 　　关键词 氯霉素；免疫抗原；合成；鉴定 　　中图分类号 R927.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）14-0271-01 　　氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种应用比较广泛的抗生素，对家禽、家畜、水产养殖动物传染病的预防、控制和治疗起着相当重要的作用[1-5]。但是氯霉素存在严重的副作用，会造成人的再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症等疾病。因此，我国农牧发文规定[1]，在马肝、鸡肉、真鲷肌肉中的氯霉素残留限量均不得检出。一般情况下，对氯霉素的检测大多采用仪器分析，但存在一定缺陷，如样品前处理及测定过程操作繁琐、费用高、不适用于大量样品。如果采用免疫酶技术方法，如ELISA方法，其具有高灵敏度、高特异性、操作简单等特点适用于大量样品和现场检测[6-10]。该研究将采用重氮合成方法把氯霉素和牛血清白蛋白偶联制成免疫原，为以后制备多克隆和单克隆抗体做准备。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 供试试剂。氯霉素标准品（纯度99.5%，购自中国药品生物制品检定所；超纯水由Milli—Q liocel纯水器制备）；锌粉（化学纯，购自华东医药公司）；稀释缓冲液：pH值7.4， 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（将8.00 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、3.58 g Na2HPO4·12H2O溶于800 mL去离子水中，用NaOH或HCl调节pH值到7.2～7.4，定容至1 000 mL）；聚乙二醇6000（PEG6000）（上海浦东高南化工厂）；牛血清白蛋白（BSA）（分子量68000，Sigma公司）。 　　1.1.2 供试仪器。分析天平（万分之一，Sartorius）；冷冻离心机（日立Himac CR22G）；旋涡震荡仪（IKA公司）；78HW-1型恒温磁力搅拌器；各种规格移液枪（Eppendorf）（20 L、200 L、1 000 L、300 L十二道移液枪）；紫外分光光度计（岛津）；电泳仪（？魧KTA FPLC）；4、-20 ℃冰箱。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 氯霉素人工抗原CAP-BSA的制备。按参考文献[5]的方法先将氯霉素转变成重氮化合物，然后将BSA溶于磷酸盐缓冲液，再将重氮盐逐滴加入BSA溶液中，搅拌并偶联制备免疫抗原（CAP-BSA）。 　　1.2.2 氯霉素人工抗原CAP-BSA的紫外扫描检测。采用紫外分光光度计对BSA和CAP-BSA进行紫外扫描检测，从而判断CAP与BSA偶联的人工抗原交联是否成功。所用的稀释液是磷酸缓冲溶液（PBS），同时扫描空白对照溶液是稀释液PBS。具体步骤：先将BSA用磷酸缓冲溶液稀释成浓度为0.25 mg/mL的溶液，然后将人工抗原CAP-BSA也稀释成0.25 mg/mL的溶液，最后分别将样品进行紫外扫描分析。 　　1.2.3 氯霉素人工抗原CAP-BSA的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人工抗原交联是否成功。用PBS液将BSA稀释成浓度为0.25 mg/mL的溶液，将CAP-BSA稀释成0.25 mg/mL蛋白溶液，分别进行凝胶电泳分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 CAP-BSA的紫外扫描情况 　　已知CAP在277.40 nm波长处有最大吸收峰，而紫外扫描结果显示，BSA最大吸收峰在278.00 nm波长处，CAP-BSA在277.80 nm波长处有最大吸收峰（图1）。根据紫外吸收的加合性原理，可以初步证明，半抗原CAP与载体BSA交联成功。 　　2.2 CAP-BSA的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳情况 　　合成的免疫抗原和BSA标准品用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，结果如图2所示。可以看出，BSA和CAP-BSA的条带几乎平行；但CAP-BSA的条带出现细微的偏移，主要是因为里面含有未偶联和偶联上CAP的BSA混合物。从该电泳图谱可能无法完全证实CAP-BSA偶联是否成功。 　　3 结论与讨论 　　采用重氮法，将氯霉素（CAP）与牛血清白蛋白（BSA）连接，制备人工免疫原CAP-BSA，经紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验证实人工免疫抗原合成成功， 　　4 参考文献 　　[1] 关于下达2001年度兽药残留监控计划的通知[EB/OL].[2013-05-18].http：///ztzl/x