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一株无毒力鸭疫里默氏杆菌分离与鉴定 　　摘要：从湖北某地淘汰鸭的脑组织分离到一株短杆菌，命名为JLLY，经分离培养、形态学检查、生理生化试验、PCR鉴定及测序结果的分析，分离菌株被鉴定为鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）。在毒力测定试验中，将不同浓度的菌液腿部肌肉注射5日龄健康雏鸭。结果显示，分离株JLLY注射的试验动物无一死亡，可确定为无毒力。 　　关键词：鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）；分离鉴定；毒力试验 　　中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5539-02 　　鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种细菌性传染病，又称鸭传染性浆膜炎[1]，是主要侵害2～8周龄雏鸭的一种高致病性接触性传染病，目前已成为危害养鸭业的主要病原之一[2]；该菌主要侵害雏鸭，很多报道也都是从发病雏鸭中分离到该菌[3，4]，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室从某鸭场淘汰的400多日龄种鸭脑组织分离到一株鸭疫里默氏杆菌，在毒力鉴定试验中发现为无致病性的菌株，现将相关研究报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 　　TSA、TSB培养基（BD公司）；无支原体胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；PT-2000 PCR仪、Model 3000Xi电泳仪（BioBAD公司）；Agarose Gel DNA Extraction Kit、琼脂糖（OMEGA公司）。 　　1.2 试验动物 　　1日龄的麻鸭，购自湖北某鸭场，饲养到5日龄确认健康。 　　1.3 细菌的分离 　　在无菌条件下，打开淘汰蛋鸭脑部，用接种环化线接种于含5%胎牛血清的TSA平板，37 ℃烛缸培养18 h，进一步挑取疑似菌落进行纯化培养。 　　1.4 分离菌株的鉴定 　　1.4.1 形态及染色特性 将纯化培养的疑似菌株进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。 　　1.4.2 生理生化试验 挑取典型菌落接种于含有5%胎牛血清的TSB培养基中，37 ℃摇床培养18～24 h，取少量菌液滴加到H2S、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、枸橼酸盐、触酶、半固体琼脂、葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木糖等16种细菌生化鉴定管中，置于37 ℃恒温培养箱中培养，按照所购鉴定管的说明书操作，观察细菌的生化特性。 　　1.4.3 PCR鉴定及产物纯化 根据文献[5]的RA 16S rRNA基因序列，合成引物P1、P2，目的片段为662 bp。上游引物（P1）：5′-CAGCTTAACTGTAGAA 　　CTGC-3′，下游引物（P2）：5′-TCGAGATTTGCATCA 　　CTTCG-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　PCR反应体系为：5 μL 10×buffer（含Mg2+），2 μL dNTPs，1 μL上游引物，1 μL下游引物，2 μL模板，0.5 μL Taq酶， 17.0 μL H2O；反应条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，切下目的片段，用Agarose Gel DNA Extraction Kit纯化回收DNA。 　　1.4.4 测序与序列分析 扩增出的目的基因片段回收后送往北京英骏公司测序。测序结果用BLAST（http：///BLAST）在线进行同源搜索。 　　1.4.5 毒力测定 将分离的纯化菌株挑单个菌落接种到TSB（含2%犊牛血清）上，37 ℃振荡培养18 h，然后10倍数量级倍比稀释后每个稀释度涂布3个平板做细菌计数。然后用无菌生理盐水，将菌液稀释至1×1010、1×109、1×108、1×107 CFU/mL 4个稀释度，每个稀释度腿部肌肉多点注射0.5 mL；以RAXY强毒株（本实验室分离保存）为阳性对照，用无菌生理盐水将菌液稀释至1×109、1×108、1×107、1×106 CFU/mL；生理盐水作空白对照，接种后每天观察数次，连续观察7 d，记录各组雏鸭的发病、死亡情况。 　　2 结果与分析 　　2.1 细菌分离鉴定及革兰氏染色 　　经37 ℃烛缸培养18 h后，TSA固体培养基上长出白色凸起的圆形小菌落，对着光线可见菌落为透明且有特殊折射光。纯培养物经革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性短杆菌。 　　2.2 生理生化特性 　　纯化菌株不能发酵各种糖类，枸橼酸盐和触酶阳性，具体结果见表1。