一株类胡萝卜素高产菌筛选与鉴定.docVIP

一株类胡萝卜素高产菌筛选与鉴定 　　摘要：以自然环境中松树林土壤、下水道淤泥、饭店周围油腻土壤、农田土壤、落花、十字花科蔬菜、辣椒以及实验室空气为类胡萝卜素产生菌的初分离材料，采用酸-热破壁法用丙酮提取类胡萝卜素，根据单位体积发酵液类胡萝卜素产量确定了一株高产光合细菌（BSⅡ6）。进一步对其形态、生理生化特征、类胡萝卜素产量、分子生物学特征进行了初步研究，初步鉴定菌株BSⅡ6为无色杆菌属的一个种Achromobacter sp.，BSⅡ6所产色素主要成分为番茄红素，类胡萝卜素产量达到了7.46 μg/mL。 　　关键词：类胡萝卜素；菌种；筛选；鉴定；发酵；无色杆菌属（Achromobacter） 　　中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2389-04 　　类胡萝卜素（Carotenoids）是自然界中广泛存在的色素，是萜烯基团类的不饱和化合物，结构中有许多共轭双键。由于它是维生素A前体，同时又具有抗氧化、预防和抑制肿瘤、增加宿主免疫力等功能，已被广泛应用于食品、饲料、化妆品、医药工业。目前，主要是通过化学合成法、植物提取法获得类胡萝卜素，少数是由微生物发酵生产。化学合成色素由于毒性问题而受到限制，从植物中提取类胡萝卜素难以大量生产，且成本较高。因此，利用微生物发酵获取类胡萝卜素是较好的方式。目前，国内外利用微生物合成类胡萝卜素的研究主要集中在三孢布拉霉菌和红酵母方面。其中，三孢布拉霉菌菌株生长迅速、生物量高，是国际上采用的实现工业化生产的优良菌株。前苏联和东欧地区已达小规模工业生产水平，但技术工艺较为复杂。在我国，该方法正处于研究阶段。自21世纪90年代初以来，我国对此方法进行了大量研究，但发酵过程中存在一系列复杂的技术性问题，如发酵液黏稠度高、溶解氧利用难等，从而距大规模工业化生产还有相当的一段距离。利用光合细菌生产类胡萝卜素，虽然目前色素发酵水平比三孢布拉霉菌低，但也具有一定的优点：可以利用蔗糖、废糖蜜等进行培养，成本较低廉；周期短，发酵控制容易，有利于工业化生产。因此，无论是从品质技术、资源还是成本等因素考虑，研究光合细菌生产类胡萝卜素都具有一??的应用价值和开发前景。本研究从各种自然环境中分离筛选产类胡萝卜素菌株，根据单位体积发酵液类胡萝卜素产量确定了一株高产光合细菌（BSⅡ6），并对其形态、生理生化特征、类胡萝卜素产量、分子生物学特征进行了初步研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 样品来源 土样：采集了农田土壤、下水道淤泥、松树林土壤、饭店周围油腻土壤4种土样。落花：收集了樱花、油菜花、白菜花、迎春花、萝卜花、豌豆花、鸢尾花、不知名野花8种植物的花。蔬菜：十字花科蔬菜、辣椒等采集于贵阳市花溪区农家菜园。还有实验室空气。 　　1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基配方为牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 7.0～7.2，于121 ℃灭菌30 min。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方为马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 自然；配制方法为马铃薯去皮切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加葡萄糖及琼脂，溶化后补足水至1 000 mL，于121 ℃灭菌30 min。种子培养基配方为葡萄糖5 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，于115 ℃灭菌20 min。发酵培养基[2]配方为葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，Na2HPO4 1 g/L，KH2HPO4 1 g/L，pH 6.0（真菌）、7.2～7.4（细菌），于121 ℃灭菌30 min。 　　1.2 方法 　　1.2.1 菌株的分离筛选 　　1）土样菌株的分离。采用稀释平板法。先用研钵将混匀的土样磨碎，称取新鲜土壤10 g，放入盛有100 mL无菌水的250 mL三角瓶内（三角瓶内有玻璃珠），然后放在摇床上以70 r/min振荡10 min，静置片刻，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培养48 h，挑出呈黄色、红色、橙黄色的菌落进一步纯化，获得纯培养，并接种于斜面培养基保存。 　　2）落花菌株的分离。将落花用水冲干净，用70%乙醇浸泡5 min，在牛肉膏蛋白胨平板上涂抹接种，后续操作与土样菌株的分离相同。 　　3）蔬菜内生菌的分离。①内生细菌的分离：将植株用水冲洗干净，然后随机称取根、茎、叶各器官0.5 g，用70%乙醇浸泡5 min，再用1 g/L HgCl2表面消毒5～10 min（叶片5 min，根、茎10 min），用无菌水冲洗3次，样品晾干后转入无菌研钵中研磨匀浆。加10 m